3. Механическая система - тубус (2), штатив (8), колонка (9) и предметный столик (10).

а) С колонкой связаны макро- и микрометрический винты.

Они поднимают и опускают тубус для фокусировки изображения объекта на сетчатке глаза наблюдателя.

В итоге, световые лучи проходят следующий путь:

источник света (4) зеркало (5) конденсор (6) диафрагма (7) препарат объектив (1) тубус (2) окуляр (3).

Т.е. микроскопия ведётся в проходящем свете, для чего препарат должен быть достаточно тонким.Заметим также, что микроскоп даёт перевёрнутое изображение объекта.

Для получения правильной информации необходимо последовательное микроскопическое изучение всего цитологического мазка. Обзор цитологической картины проводят под малым увеличением (х10), детализацию выбранных объектов – под увеличением (х20, х40); далее микроскопическое изучение мазка выполняется под иммерсионным объективом (х90, х100). Вначале проводят систематическое изучение полей зрения по краю мазка. Затем мазок исследуют методом «систематического перекрестного двухразового шага», который позволяет практически без пропуска изучить каждый миллиметр площади препарата.

Подсобными методами является фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия с использованием флюорохрома, которая применяется преимущественно при массовых профилактических осмотрах женщин. Люминесцентный метод позволяет видеть клетки и различать их по цвету свечения, возникшего под влиянием флюорохрома, фазово-контрастный – рассмотреть особенность клеток, не прибегая к фиксации и окраске (в нативном состоянии) даже с иммерсионной системой. Оба метода не требуют много времени на подготовку препарата, однако и не сокращают срока его исследования и не всегда дают возможность уточнить диагноз. Метод нативного препарата при световом микроскопе в цитологическом исследовании играет ориентировочную роль и используется в общем клинико-лабораторном анализе.

Оценка качества окрашенного цитологического препарата.

Качественное окрашивание позволяет правильно идентифицировать клеточные элементы мазка и оценить их особенности при микроскопии.

Хороший качественно окрашенный мазок должен:

- равномерно окрашиваться;

- не содержать артефакты (рыхлые скопления краски) и сморщенные клетки;

- иметьв достаточном количестве равномерно распределенные клетки (все участки мазка должны хорошо просматриваться и не содержать "толстые участки", содержащие непросматриваемые (плохо просматриваемые) скопления или комплексы клеток);

-окрашивать элективноструктуры цитоплазмы, ядра, ядерного хроматина, ядрышек.

В основе окрашивания клеток лежат физико-химические процессы (диффузия, адсорбция, абсорбция, растворимость и др.), происходящие как в красителе, так и в микроструктурах.

При применении любой методики окрашивание мазка важно точно соблюдать последовательность процедур приготовления растворов и временные промежутки в течение процесса окрашивания.

Существующие в продаже партии красителя имеют различную интенсивность окраски. Это обязывает опытным путём установить оптимальные концентрации (разведение) и время окрашивания для каждого флакона красителя, который устанавливает при окрашивании серии препаратов растворами с различной концентрацией красителя, меняя длительность его воздействия. При приготовлении растворов необходимо учитывать рН воды: она должна быть нейтральной (рН 6,8 – 7, 2) что обеспечивается использованием буферных растворов.

Рекомендуемые методы окрашивания цитологических мазков: азур – эозиновый, по Романовскому – Гимзе, Лейшману, Маю–Грюнвальду, Паппенгейму; гематоксилин – эозиновый, метод Папаниколау.

Самым распространённом методом окраски является окраска гематоксилин-эозином. Сочетает в себе основной и кислый красители, поэтому позволяет выявить почти все клетки и многие неклеточные структуры (ядра приобретают сине-фиолетовый цвет, цитоплазма – желтовато-розовый цвет). Гематоксилин сам по себе не является красящим веществом. Для того чтобы приготовить краску, гематоксилин подвергают окислению (по методу Эрлиха, Майеру, Караци –калийными квасцами), в результате чего он превращается в красящее вещество – гематеин (сине-фиолетовый краситель). При этом на окисление гематоксилина требуется от 10 дней до 2 - 3 недель. Этот процесс ускоряют с помощью солей алюминия, хрома, железа и др.

• Квасцовый гематоксилин Майера приготовляют следующим образом: в литре дистиллированной воды растворяют 1 г гематоксилина, 0,2 г йодновато-кислого натрия (KaJ03) и 50 г калийных квасцов. Затем добавляют 50 г хлоралгидрата и 1 г кристаллической лимонной кислоты. Раствор годен для немедленного употребления и долгое время хорошо сохраняется. Препарат красят в течение 5 – 10 минут, после чего 10 минут промывают в проточной воде.

• Квасцовый гематоксилин по Эрлиху. Для приготовления красителя 2 г гематоксилина растворяют в 100 см³ 96-градусного спирта и добавляют 100 см³ воды, 100 см³ химически чистого глицерина, 3 г калийных квасцов и 10 см³ уксусной кислоты.

Краситель должен «созревать» примерно 14 дней. Раствор сохраняет свою красящую силу долгое время. Если вместо гематоксилина взять 0,25 – 0,5 ггемагина, то краситель пригоден к употреблению тотчас же после изготовления. Окрашивание производят так же, как и гематоксилином Майера. Ядра окрашиваются в темно-синий цвет.

• Квасцовый гематоксилин по Караци. Гематоксилина – 0,5 г, калийных квасцов – 25г, нодноватокислого калия КГО₃ – 0,01 г, глицерина – 100 см3, дистиллированной воды – 400 см3.

Преимуществом гематоксилиз-эозиновых красителей является выраженное окрашивание ядер с атипией, в связи с чем этот метод хорошо использовать для исследования мазков при скрининге.

Окраска азур – эозиновыми красителями.

Метод окрашивания по Романовскому (азур-эозиновой смесью) в разных лабораториях используется в разных модификациях – по Паппенгейму (Май-Грюнвельду-Гимзе), Лейшману, Романовскому-Гимзе и т.д. Преимущество метода является четкое прокрашивание ядер, вследствие чего хорошо просматриваются структуры хроматина, а также бактериальная флора и простейшие.