4.2. Микроскопические методы

4.2.1. Копроовоскопия (исследование фекалий на яйца гельминтов).

4.2.1.1. Метод толстого мазка под целлофаном по Като и Миура.

Толстый мазок представляет собой тонкий слой фекалий на предметном стекле под гигроскопическим целлофаном, пропитанным смесью глицерина и фенола.

Необходимые реактивы и оборудование

1. Глицерин.

2. Фенол - 6%-ный раствор (100 мл дистиллированной воды + 6 г фенола).

3. Малахитовый зеленый - 3%-ный раствор (2,5 г малахитовой зелени + 75 мл дистиллированной воды).

4. Целлофан (гигроскопический).

5. Предметные стекла.

6. Палочки стеклянные или деревянные.

7. Валик или резиновая пробка.

8. Микроскоп.

Подготовка к работе

Приготовление рабочего раствора Като

100 мл 6%-ного р-ра фенола + 100 мл глицерина + 1,2 мл 3%-ного р-ра малахитового зеленого (раствор можно хранить длительное время в склянке из темного стекла с притертой крышкой).

Фенол дезинфицирует препарат; глицерин просветляет мазок; малахитовая зелень снимает напряжение глаз микроскописта.

При отсутствии фенола и малахитовой зелени можно использовать раствор глицерина (50 мл глицерина + 50 мл дистиллированной воды).

Подготовка целлофановых полосок

Нарезать полоски из гидрофильного целлофана (гидрофильный целлофан горит, в отличие от полиэтиленовой пленки, которая плавится и непригодна для исследования), чтобы их размер соответствовал размеру предметного стекла.

Полоски поместить в рабочий раствор Като не менее чем на 24 ч до проведения анализа. В 200 мл рабочего раствора можно обрабатывать до 5 тыс. новых целлофановых полосок.

Ход исследования

На предметное стекло нанести 30 - 50 мг фекалий (размером с горошину). Растереть индивидуальной палочкой (стеклянной, деревянной).

Фекалии накрыть целлофановой полоской, обработанной в растворе Като.

Целлофан сверху притереть резиновой пробкой или специальным валиком, ширина которого соответствует или немного больше ширины предметного стекла, до получения тонкого, равномерного, прозрачного слоя.

Препарат выдержать при комнатной температуре в течение 1 ч или в термостате при 40 °C в течение 20 - 30 мин.

Микроскопировать при увеличении: объектив х 8 или х 10, окуляр х 7 или х 10 (для уточнения морфологического строения яиц гельминтов объектив х 40).

Эффективность метода

Позволяет просмотреть в 20 - 30 раз больше фекалий, чем в нативном мазке.

Выявляет яйца кишечных и печеночных гельминтов при высокой и средней интенсивности инвазии.

Менее эффективен для выявления инвазий низкой интенсивности.

Применение метода

Рекомендуется при массовых обследованиях населения на кишечные гельминтозы, например: при обследовании декретированных контингентов взрослого населения и детей организованных коллективов.

В клинико-диагностических лабораториях, когда в направлениях врачей отсутствуют конкретные диагнозы или указания, на какие инвазии необходимо обследовать больного, что не позволяет лаборанту выбрать специальные методы лабораторной диагностики.

Препараты, приготовленные методом Като, можно сохранять при комнатной температуре в течение длительного времени (за исключением яиц анкилостомид и карликового цепня) в качестве музейных препаратов.

4.2.1.2. Формалин-эфирный метод (седиментация)

Необходимые реактивы и оборудование

1. Раствор формалина 10%-ный (10 мл формалина аптечного + 90 мл дистиллированной воды).

2. Этиловый эфир медицинский.

3. Раствор Люголя 1%-ный.

4. Центрифужные градуированные пробирки.

5. Воронки стеклянные.

6. Металлическое ситечко чайное или бинт (марля).

7. Предметные и покровные стекла.

8. Деревянные и стеклянные палочки.

9. Пипетки.

10. Резиновые пробки.

11. Микроскоп.

12. Центрифуга на 3000 об./мин.

Ход исследования

В центрифужные градуированные пробирки налить 7 мл 10%-ного раствора формалина.

Добавить 1 г фекалий (такое количество фекалий, чтобы раствор в пробирке поднялся до 8 мл).

Фекалии тщательно смешать при помощи палочки (индивидуальной для каждого обследуемого) с формалином до образования однородной смеси.

Процедить через воронку с металлическим ситечком или двухслойным бинтом в другую центрифужную пробирку (чтобы в новой пробирке процеженного раствора снова было 8 мл, если меньше, то дополнительно можно сполоснуть 10%-ным раствором формалина воронку с бинтом, через который процеживали раствор фекалий).

Добавить в эту пробирку 2 мл эфира, т.е. до метки 10 мл, закрыть пробкой и энергично встряхивать в течение 30 с (встряхивать желательно в вытяжном шкафу, в горизонтальном положении, придерживая при этом пробку).

Смесь центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 1 мин. (или в течение 2 мин. при 1500 об./мин.).

После центрифугирования в пробирке образуется 4 слоя: эфир, "каловая пробка", раствор формалина и на дне осадок, в котором будут содержаться яйца гельминтов и цисты простейших.

"Каловую пробку" палочкой отделить от стенок пробирки и вместе с надосадочной жидкостью вылить, перевернув пробирку вверх дном, с краев пробирки убрать ватным тампоном лишнюю влагу, чтобы она не стекала на дно пробирки, перевернуть пробирку опять дном вниз.

Осадок, оставшийся на дне пробирки (весь), нанести на предметное стекло пипеткой или непосредственно из пробирки; капли должны быть небольшими, по 2 капли на одном предметном стекле.

При исследовании на цисты простейших в одну из капель осадка внести каплю 1%-ного раствора Люголя (приготовление в п. 4.2.4.1).

Капли накрыть покровным стеклом (жидкость не должна выступать за края стекла или затекать на покровное стекло).

Каплю с раствором Люголя исследуют на цисты и ооцисты простейших, а каплю без Люголя исследуют на яйца и личинки гельминтов.

Микроскопировать: на яйца и личинки гельминтов при увеличении - объектив х 8 или х 10, окуляр х 7 или х 10, для уточнения морфологического строения яиц гельминтов - объектив х 40; на цисты простейших - объектив х 40.

Эффективность метода

Эффективно выявляет инвазии с высокой, средней и низкой интенсивностью.

Применяется для выявления яиц, личинок гельминтов кишечника и печени, цист и ооцист простейших кишечника, но практически не выявляет стадии трофозоитов.

Не снижает эффективности при исследовании фекалий из консервантов.

Применение метода

Применяется как универсальный метод диагностики кишечных и печеночных гельминтозов и протозоозов при диагностических и эпидемиологических обследованиях населения.

Используется как специальный метод для диагностики трематодозов, включая описторхоз.

Используется как количественный метод диагностики.

4.2.1.3. Уксусно-эфирный метод (седиментация)

Необходимые реактивы и оборудование

1. Водный раствор уксусной кислоты 5%-ный (5 мл ледяной уксусной кислоты + 95 мл дистиллированной воды).

2. Раствор Люголя 1%-ный.

3. Этиловый эфир медицинский.

4. Центрифужные градуированные пробирки.

5. Воронки стеклянные.

6. Металлическое ситечко чайное или двухслойный бинт.

7. Предметные и покровные стекла.

8. Палочки деревянные и стеклянные.

9. Пипетки.

10. Бинт (марля).

11. Резиновые пробки.

12. Микроскоп.

13. Центрифуга на 3000 об./мин.

Ход исследования

В центрифужные градуированные пробирки налить 5 мл 5%-ного раствора уксусной кислоты.

Добавить 1 г фекалий (количество фекалий, чтобы раствор в пробирке поднялся до 6 мл).

Фекалии тщательно смешать с уксусной кислотой при помощи палочки (индивидуальной для каждого обследуемого), закрыть пробирку резиновой пробкой и интенсивно встряхнуть до образования однородной смеси и дать постоять 1 мин.

Процедить через воронку с металлическим ситечком или двухслойным бинтом в другую центрифужную пробирку (чтобы в новой пробирке процеженного раствора снова было 6 мл, если меньше, то дополнительно можно сполоснуть 5%-ным раствором уксусной кислоты воронку с бинтом, через который процеживали суспензию фекалий).

Добавить в эту пробирку 4 мл эфира, т.е. до метки 10 мл, закрыть пробкой и энергично встряхивать в течение 30 с, держа при этом пробирку в горизонтальном положении (встряхивать в вытяжном шкафу, придерживая пробку), до получения эмульгированной смеси.

Смесь центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 1 мин. или в течение 2 мин. при 1500 об./мин.

После центрифугирования в пробирке различают 4 слоя: в верхней части пробирки эфирный экстракт, образовавшаяся "каловая пробка", раствор уксусной кислоты и на дне небольшой осадок.

Уксусная кислота эмульгирует фекалии, проникает в непереваренные частицы, состоящие преимущественно из клетчатки; удельный вес смеси эфира с уксусной кислотой меньше удельного веса воды, поэтому фекалии вместе с неперевареными крупными частицами клетчатки поднимаются в виде пробки в верхнюю часть пробирки, а яйца гельминтов и цисты простейших, обладающие большим удельным весом, выпадают в осадок.

"Каловую пробку" круговым движением палочки отделить от стенок пробирки и вместе с надосадочной жидкостью вылить, при этом излишки влаги удалить ватным тампоном с края пробирки, оставив на дне осадок.

Осадок (как правило, небольшой, бесцветный) нанести на предметные стекла пипеткой или непосредственно из пробирки, капли должны быть небольшими, по 2 капли на одном предметном стекле.

Перед исследованием на цисты простейших в одну из капель осадка внести каплю 1%-ного раствора Люголя.

Обе капли накрыть покровным стеклом (осадок не должен выступать за края стекла или затекать на покровное стекло).

Каплю с раствором Люголя исследуют на цисты и ооцисты простейших, а каплю без Люголя исследуют на яйца и личинки гельминтов.

Микроскопировать: на яйца и личинки гельминтов при увеличении - объектив х 8 или х 10, окуляр х 7 или х 10, для уточнения морфологического строения яиц гельминтов - объектив х 40; на цисты простейших - объектив х 40.

Эффективность метода

Эффективно выявляет инвазии с высокой, средней и низкой интенсивностью.

Применяется для выявления яиц, личинок гельминтов кишечника и печени, цист и ооцист простейших кишечника, т.к. 5%-ный раствор уксусной кислоты не оказывает деформирующего воздействия на цисты и ооцисты простейших (при исследовании оформленных и неоформленных фекалий), но не сохраняет стадии трофозоитов.

Не снижает эффективности при использовании фекалий из консервантов.

Применение метода

Применяется как универсальный метод диагностики кишечных и печеночных гельминтозов и протозоозов при диагностических и эпидемиологических обследованиях населения.

Используется как специальный метод для диагностики трематодозов, включая описторхоз.

Используется как количественный метод диагностики.

4.2.1.4. Химико-седиментационный метод

Необходимые реактивы и оборудование

1. Азотно-кислый натрий.

2. Раствор уксусной кислоты 1%-ный.

3. Раствор уксусной кислоты 10%-ный.

4. Эфир этиловый медицинский.

5. Ареометр.

6. Воронки стеклянные.

7. Марля (бинт).

8. Центрифужные пробирки.

9. Предметные и покровные стекла.

10. Пипетки стеклянные.

11. Стеклянные или деревянные палочки.

12. Центрифуга.

13. Микроскоп.

Подготовка к работе

Приготовить рабочие растворы:

1) азотно-кислого натрия с удельным весом 1,15

- готовят из расчета 800 - 900 г вещества (необходимо подобрать количество индивидуально, т.к. химическое вещество из разных расфасовок может дать разный удельный вес) на 1 л горячей воды в эмалированной посуде, соль кладут в емкость с горячей водой порциями при подогревании на плите и постоянном помешивании до полного растворения;

- после остывания приготовленного раствора проводят измерение удельного веса ареометром при комнатной температуре.

Если раствор готовится заранее, необходимо приготовить с более высоким удельным весом, т.к. уже через 24 ч удельный вес начинает падать;

2) растворы уксусной кислоты 1%-ный и 10%-ный.

Ход исследования

В градуированную центрифужную пробирку налить 6 мл рабочего раствора азотно-кислого натрия.

В другую пробирку налить 7 мл 1%-ного раствора уксусной кислоты.

В пробирку с уксусной кислотой внести пробу фекалий 0,5 - 1 г (до отметки 7,5 - 8 мл).

Тщательно перемешать фекалии стеклянной палочкой.

Процедить через воронку с одним слоем марли (бинта) в пробирку с азотно-кислым натрием.

Центрифугировать при 1500 - 2000 об./мин. в течение 5 мин.

Слить надосадочную жидкость из пробирки.

В пробирку с осадком добавить 3 - 4 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты и 0,5 мл эфира.

Закрыть резиновой пробкой и, придерживая пробку, энергично встряхнуть (в вытяжном шкафу).

Провести повторное центрифугирование в течение 1 мин.

Слить надосадочную жидкость.

Осадок перенести на предметное стекло пипеткой.

Каплю (или несколько капель) осадка накрыть предметным стеклом.

Микроскопировать при увеличении: объектив х 8 или х 10, окуляр х 7 или х 10; для уточнения морфологического строения яиц гельминтов - объектив х 40.

Эффективность метода

После дополнительной обработки осадка химреактивами в нем остаются только яйца гельминтов, что облегчает их выявление.

По эффективности выявления примерно одинаков с уксусно-эфирным осаждением, но более трудоемок.

Применение метода

Применяется для выявления яиц гельминтов кишечника, печени.

Примечание. В основе методов седиментации (осаждения), описанных в п. п. 4.2.1.2, 4.2.1.3, 4.2.1.4, лежит разность удельного веса используемых химреактивов и яиц гельминтов, когда удельный вес яиц большой и они концентрируются в осадке.

4.2.1.5. Методы флотации

В основе методов флотации (всплывания) лежит разность удельного веса флотационного раствора и яиц гельминтов, удельный вес флотационного раствора выше, в результате яйца гельминтов всплывают на поверхность жидкости и обнаруживаются в поверхностной пленке.

Необходимые реактивы и оборудование

1. Один из флотационных растворов.

2. Ареометр.

3. Проволочная петля (из нескольких круглых петель диаметром от 0,5 до 1 см).

4. Предметные стекла (обезжиренные).

5. Пипетки стеклянные.

6. Химические стаканчики емкостью 30 - 50 мл.

7. Кюветы эмалированные.

8. Чашки Петри.

9. Стеклянные или деревянные палочки.

10. Спиртовка.

Подготовка к работе

Приготовление флотационного раствора (по одной из нижеописанных прописей).

1. Раствор нитрата аммония NH NO (гранулированной или

4 3

обычной селитры) плотностью 1,3 готовят из расчета 1500 г

вещества на 1 л горячей воды.

2. Раствор нитрата натрия NaNO или азотно-кислого натрия

3

(предложенный автором Калантарян) с плотностью 1,38 - 1,4

готовят из расчета 1000 г вещества на 1 л горячей воды.

3. Раствор тиосульфата натрия Na S O x 5 H O (гипосульфита

2 2 3 2

натрия) с плотностью 1,4 готовят из расчета 1750 г вещества

на 1 л горячей воды.

4. Раствор сульфата натрия Na SO или английской соли с

2 4

плотностью 1,26 - 1,28 готовят из расчета 920 г вещества на

1 л горячей воды.

5. Насыщенный раствор хлорида натрия NaCl (поваренной соли) с плотностью 1,18 - 1,2 (предложенный автором Фюллеборном) готовят из расчета 400 - 420 г соли на 1 л кипящей воды.

Любую из вышепредложенных солей растворяют в горячей воде в эмалированной посуде, причем кладут соль в емкость с горячей водой порциями при подогревании на плите и постоянном перемешивании до полного растворения.

Удельный вес флотационных растворов измеряется ареометром только после остывания раствора при комнатной температуре.

Измерение удельного веса флотационного раствора ареометром строго обязательно, т.к. приготовление раствора по прописи не гарантирует получение нужного удельного веса (например, когда используемая соль недостаточно химически чистая).

Фильтровать приготовленные растворы не обязательно. Если раствор приготовлен в большом количестве, то в последующие дни перед исследованием его подогревают с размешиванием осадка и после остывания раствора снова измеряют ареометром удельный вес.

Подготовка предметных стекол: предметные стекла обязательно обезжирить, например в смеси Никифорова (равные части этилового спирта и эфира).

Ход исследования

В химический стаканчик объемом 30 - 50 мл налить немного одного из вышеописанных флотационных растворов (стаканчик лучше предварительно поставить в чашку Петри).

Поместить в стаканчик 2,5 г фекалий (объем с большой "боб").

Тщательно размешать палочкой (индивидуальной для каждого обследуемого).

Удалить сразу же после размешивания всплывшие крупные частицы палочкой (или ложечкой с дырочками).

Одновременно добавлять постепенно солевой раствор до 50 мл.

При снятии поверхностной пленки предметным стеклом стекло должно соприкасаться с жидкостью, поэтому стаканчик накрывается предметным стеклом, а флотационный раствор добавляется пипеткой до полного соприкосновения с предметным стеклом.

Оставить взвесь на несколько мин., экспозиция зависит от того, какой флотационный раствор применяется: при применении прописи N 1 и 5 - экспозиция 30 - 60 мин.; N 2, 3, 4 - 30 мин.

После вышеуказанной экспозиции снять предметное стекло с химического стаканчика, перевернув кверху ту его поверхность, которой оно соприкасалось с жидкостью, и положить сухой поверхностью на стекло большего размера.

Микроскопировать без покровного стекла при увеличении: объектив х 8, х 10, окуляр х 7, х 10, уточнение морфологического строения - окуляр х 40.

При снятии поверхностной пленки проволочной петлей (лучше использовать петли с несколькими ячейками) целесообразно исследовать не менее 8 капель. Микроскопировать под покровным стеклом (можно и без покровного стекла, предварительно на предметное стекло нанеся каплю глицерина, в которой размазывают каплю с петли).

Петли перед и после исследования обжигать на пламени спиртовой горелки.

64. Классическим методом лабораторной диагностики лямблиоза являются протозоологические исследования. Проводится микроскопическое исследование нативных и окрашенных раствором Люголя мазков из свежевыделенных фекалий. Учитывая циклическое выделение цист и трофозоитов с фекалиями, незначительные сроки жизни вегетативных форм во внешней среде, необходимо примененять консервирующие жидкости для сохранения паразита в фекалиях (Сафаралиева, Турдыева, Барроу) и проводить многократные исследования (от 2 - 3 до 6 - 7 раз с интервалами 1-2 дня), а также использовать метод формалин-эфирного обогащения, метод всплывания. В большинстве случаев цисты лямблий в кале обнаруживаются уже при первом исследовании. Отрицательные периоды в выделении лямблий могут колебаться от 2 - 3 суток до 2 - 3 недель. Поэтому при подозрении на лямблиоз можно также рекомендовать проводить протозоологическое исследование кала в течение 4-5 недель с интервалом в одну неделю.

В дуоденальном содержимом трофозоиты лямблий обнаруживаются с большим постоянством, чем в фекалиях. Однако при паразитировании лямблий в средних и дистальных отделах тонкой кишки результаты исследования дуоденального содержимого могут быть отрицательными, поэтому необходимо проводить исследование кала. Исследование секрета двенадцатиперстной кишки, полученного с помощью трехканального зонда в условиях вакуума, более эффективно для обнаружения паразита, чем микроскопия дуоденального содержимого, полученного с помощью обычных зондов.

Возбудитель лямблиоза - одноклеточный жгутиковый организм, встречается в двух морфологических формах - вегетативной (трофозоиты) и цистированной (цисты).

Паразит размножается путем парного деления, этот процесс занимает 15-20 мин., что способствует интенсивному поражению кишечника. Во внешнюю среду с фекалиями выделяются в основном цисты.

Цисты овальные (размер 8-14 х 7-11 мкм, в среднем 12 х 8 мкм). В цитоплазме содержится 2 или 4 ядра и свернутый жгутиковый аппарат.

Место паразитирования лямблий - верхние отделы тонкой кишки. К слизистой оболочке они прикрепляются передней частью тела, задний конец - свободный. Трофозоиты фиксируются на непродолжительное время: они либо периодически прикрепляются к различным ворсинкам, либо свободно передвигаются. При интенсивной инвазии могут проникать внутрь ворсинок. Выделение цист носит прерывистый характер. Их количество в 1 г фекалий может достигать 10 млн.

В кишечнике лямблии находятся в антагонистических отношениях с грамотрицательными бактериями, а грамположительные бактерии и грибы создают чрезвычайно благоприятные условия для их размножения. Также установлено, что культура лямблий выдерживает кратковременное замораживание, не теряя способности делиться, но температура выше +50°С вызывает их моментальную гибель.

После проглатывания животным оболочка цисты в просвете тонкой кишки разрушается, и выходят трофозоиты. Когда условия обитания резко меняются, они вновь превращаются в цисты, последние обычно и находят в кале (трофозоиты выживают в фекалиях, залитых физиологическим раствором, не более 1-2 ч). Выживают во внешней среде и обусловливают передачу инвазии только цисты. Они обладают значительной устойчивостью и в зависимости от температуры внешней среды остаются жизнеспособными: