1.2 Процесс ферментации и факторы, влияющие на его …………… эффективность

Важнейшим биохимическим процессом, протекающим при выработ­ке кисломолочных продуктов, является брожение молочного сахара, вы­зываемое микроорганизмами бактериальных заквасок, так считает К.К. Горбатова [69].

Брожение (т.е. сбраживание, ферментация) – это, в наиболее строгом смысле, анаэробный метаболический распад молекул питательных веществ, например, глюкозы, без окисления в чистом виде. Брожение не высвобождает всю имеющуюся в молекуле энергию; оно просто позволяет продолжаться гликолизу (процесс, выходом которого на одну молекулу глюкозы являются две молекулы АТФ), восполняя восстановленные коферменты. Результатом брожения являются этанол, углекислый газ, другие продукты, а далее – молочная кислота, уксусная кислота, этилен и другие восстановленные метаболиты.

Ферментация – один из старейших методов, используемых людьми для получения из молока продуктов с увеличенным сроком хранения. Трудно определить точно, когда начали изготавливать ферментированные молочные продукты. Возможно, это произошло около 10-15 тысяч лет назад, когда люди перешли от собирательства к производству пищи [504].

Существует около 400 названий традиционных и коммерческих видов ферментиро­ванных молочных продуктов [488]. Хотя эти продукты могут иметь различные назва­ния, они практически одинаковы. Основываясь на используемом виде молока, видах преобладающих микроорганизмов и основных продуктах их метаболизма, в работе [510] авторы предложили схему классификации разновидностей ферментированного молока, которая делит их на три основные категории:

• продукты, полученные с использованием молочнокислых микроорганизмов;

• продукты, полученные с использованием молочнокислых микроорганизмов и дрожжей;

• продукты, полученные с использованием молочнокислых микроорганизмов и плесеней (рис. 1.2.1).

Микроорганизмы поддерживают свой жизненный цикл посредством большого коли­чества сложных и взаимосвязанных метаболических путей, обеспечивающих как био­синтез, так и выработку энергии. Каждый конкретный метаболический путь состоит из ряда реакций, которыми, в свою очередь, управляют различные ферментные си­стемы [520].

Клетки микроорганизмов получают необходимую энергию с помощью различных си­стем: системы цитохрома для использования энергии электронов НАДН₂ (восста­новленной формы никотинамидадениндинуклеотида); ферментов, управляющих анаплеротными путями; цикла трикарбоновых кислот; ферментации.

Рис. 1.2.1 Классификация ферментированных молочных продуктов

Молочнокислые бактерии (лактококки, лейконостоки, лактобактерии, стрептокок­ки) не обладают ни одной из трех первых систем, и энергия в них может обеспечиваться лишь ферментацией углеводов [491]. Энергия образуется за счет фосфорилирования субстрата с помощью АТФ при участии ферментов цитоплазматической мембраны [500]. Культуры молочных заквасок утилизи­руют углевод (например, лактозу, являющуюся основным сахаром, присутствующим в молоке) по гомо- или гетероферментативному метаболическому пути. S. thermophilus, L. bulgaricus и Lactobacillus acidophilus (далее L. acidophilus) сбраживают лактозу гомоферментативно, а подвиды Bifidobacterium сбраживают тот же сахар гетероферментативно [378].

В.Ф. Семенихиной установлено, что цельномолочные продукты по типу протекающих при их произ­водстве микробиологических процессов, могут быть разделены на две группы:

• I группа – это пастеризованное молоко и сливки, при произ­водстве которых создаются условия для уничтожения патогенной микрофлоры, максимального снижения общей микробной обсемененности и повышения стойкости этих продуктов в хранении;

• II группа – это творог, сметана, кисломолочные напитки, при производстве которых должны создаваться условия, благоприятные для развития микрофлоры, вносимой с закваской, и неблагоприят­ные для размножения санитарно-показательной и патогенной микро­флоры [344].

Г.Д. Мюнх, Х. Заупе, М. Шрайтер отмечают, что только у части молочных продуктов микроорганизмы высту­пают преимущественно как вредители и для обеспечения каче­ства и сохранения здоровья людей количество их должно быть минимально. Большую часть молочных продуктов не­возможно изготовить без участия микроорганизмов. К ним от­носятся кислосливочное масло, кисломолочные продукты и все сорта сыра, за исключением плавленого. Основополагающими были исследования Пастера (1857 г.) по мо­лочнокислому брожению, введение чистых культур (заквасок) молочнокислых бактерий (в 1888 г. Шторхом в Дании, в 1890 г. Вигманном в Германии) и неустанные усилия Хенеберга (1871-1936 гг.) по внедрению заквасок в производство масла и сыра.

Важное значение для заквасок в молочной промышленности имеют молочнокислые бактерии, их способность сквашивать и свертывать молоко. Закваски, состоя­щие из молочнокислых бактерий, особенно стрептококков, применяют как основные закваски для большинства ферментиро­ванных молочных продуктов [227, 450, 453, 454, 460].

В молоке при ферментации могут протекать шесть основных реак­ций; в результате образуется молочная, пропионовая или лимонная ки­слота, спирт, масляная кислота или же происходит колиформное газо­образование. Главная из этих реакций – образование молочной кислоты. На ней основаны все способы ферментации (сквашивания) молока. Лак­тоза молока гидролизуется с образованием галактозы и глюко­зы. Обычно галактоза превращается в глюкозу еще до сквашивания. Имеющиеся в молоке бактерии преобразуют глюкозу в молочную ки­слоту. Образование сгустка казеина происходит в изоэлектрической точке этого белка (рН 4,6) под действием молочной кислоты.

Различные процессы ферментации молока проводят сегодня в контролируемых условиях. В течение тысячелетий они осуществля­лись при участии бактерий, изначально присутствующих в молоке. В наше время для этого используют разнообразные закваски, позволяющие получать молочные продукты нужного качества и типа. При­меняющиеся при этом культуры живых бактерий могут являться од­ним штаммом определенного вида (культуры моноштаммов), либо несколькими штаммами и/или видами (моноштаммовые или смешан­ные культуры). Коммерческие культуры-закваски состоят из бакте­рий, образующих молочную кислоту и пахучие вещества. В табл. 1.2.1 перечислены некоторые виды микроорганизмов, используемых при производ­стве молочных продуктов методом ферментации [66, 473].

Таблица 1.2.1

Функциональная роль некоторых микроорганизмов, используемых

при переработке молока

Культура	Функция	Использование
Propionibacterium P. shermanii P. petersonii	Образование вкуса, образо­вание глазков	Производство швейцар­ского сыра
Lactobacillus L. casei L. helveticus L. bulgaricus L. lactis	Образование кислоты	Созревание, закваска швейцарского сыра, про­изводство сыров типа швейцарского
Leuconostoc L. dextranicum L. citrovorum	Образование вкусовых ве­ществ из лимонной кислоты (главным образом диацетила)	Производство сметаны, сливочного масла, заква­сок
Streptococcus S. thermophilus S. lactis S. cremoris	Образование кислоты	Производство йогурта и швейцарского сыра, за­кваски для сыров

Специальные биотехнологические процессы связаны в большей степени с особенностями биообъектов. Биообъекты харак­теризуются такими показателями, как уровень структурной орга­низации, способность к размножению (или репродукции), наличие или отсутствие собственного метаболизма при культивировании в подходящих условиях. Что касается характера биообъектов, то под этим следует понимать их структурную организацию. В таком случае биообъекты могут быть представлены молекулами (фермен­ты, иммуномодуляторы, нуклеозиды, олиго- и полипептиды, и т.д.), организованными частицами (вирусы, фаги, вироиды), одно­клеточными (бактерии, дрожжи) и многоклеточными особями (нитчатые высшие грибы, растительные каллусы, однослойные культуры клеток млекопитающих), целыми организмами растений и животных.

Одноклеточные виды прокариот и эукариот могут использо­ваться в биотехнологических процессах в виде монокультур или в ассоциациях. Для сравнения можно назвать производство какого-либо антибиотика (пенициллина, рифамицина и др.) с помощью чистой культуры соответствующего продуцента, а также производ­ство кефира с помощью кефирных "зёрен" ("грибков"), в состав которых входят лактобактерии и дрожжи. Следовательно, в по­следнем случае применяют природную ассоциацию микроорганиз­мов и кефир является продуктом смешанного брожения – молоч­нокислого и спиртового. Пировиноградная кислота как ключевой продукт, возникающий из моносахаридов (моноз) после гидролиза лактозы, трансформируется лактобактериями до молочной кисло­ты, а дрожжи "доводят" тот же пируват до этанола (рис. 1.2.2).

Рис. 1.2.2 Механизм сбраживания лактозы

В природных условиях микроорганизмы, как правило, находят­ся в ассоциативных взаимоотношениях, часть из которых, несомненно, может быть введена в производство в виде самостоя­тельных биотехнологических процессов [11, 13, 20, 30].

В общем виде ферментативный процесс можно выразить следую­щим уравнением:

(1.2.1)

где Е – фермент; S – субстрат; Р – продукт реакции; K₁, К_-1, К₂ – константы скоростей реакций.

Если концентрация субстрата [S] значительно выше концентрации фермента [Е], скорость ферментативной реакции можно охарактеризо­вать уравнением Михаэлиса-Ментен:

(1.2.2)

где К_м – константа Михаэлиса; зависит от констант скоростей K₁, К_-1, К₂.

(1.2.3)

Если [S]  К_м, скорость ферментативной реакции будет равна мак­симальной лимитирующей скорости _max. Тогда _max = К₂[E],

(1.2.4)

Если [S] = К_м, скорость ферментативной реакции будет равна поло­вине максимальной скорости. Численно К_м равна концентрации суб­страта, при которой скорость реакции составляет половину максималь­ной. Графическая зависимость _max и К_м показана на рис. 1.2.3 (а).

В экспериментальных условиях работать с субстратами высокой концентрации неудобно, поэтому используют другой метод определе­ния кинетических характеристик фермента. Для этого уравнение (5) преобразуют следующим образом:

(1.2.5)

Тогда _max находят, откладывая на оси абсцисс значение 1/[S], а на оси ординат – l/.

Точка пересечения прямой К_м/_max с осью ординат (рисунок 1.2.3, б) дает величину 1/ _max , с осью абсцисс – величину – 1/К_м.

Рис. 1.2.3 Зависимость кинетики ферментативных реакций _max

от концентрации субстрата (а); кинетика ферментативных реакций

в координатах l/ – 1/S (б)

Встречаются реакции других типов, например, обратимые с одним субстратом. По такому типу идет ферментативное превращение фумаровой кислоты. Могут происходить необратимые реакции с нескольки­ми субстратами или реакции, в которых из одного субстрата образуются два продукта [13, 19, 66, 30, 439].

Ферментационная кинетика описывает рост клеток и об­разование ими различных продуктов, причем в последнем случае рассматриваются закономерности, присущие не только активно растущим клеткам, но и покоящимся (пассивированным) и погибающим клеткам [331].

Теоретические положения кинетики и особенности ферментации легли в основу разработки биотехнологий молочных и молокосодержащих продуктов.

Рост, который характеризуется увеличением массы клеток, происхо­дит, когда созданы оптималь­ные химические и физические условия: благоприятные тем­пература и рН среды, достаточ­ный запас питательных ве­ществ. Кинетика роста и обра­зования продуктов отражает способность клеток к выжива­нию в условиях окружающей среды и представляет интересный объект для изучения.

Типичная кривая роста мик­роорганизмов в условиях опре­деленной несменяемой пита­тельной среды представлена на рис. 1.2.4.

Рис. 1.2.4 Кривая роста одноклеточных микроорганизмов в несменяемой среде: I – лаг-фаза; II – переходная фаза; III – экс­поненциальная фаза;

IV –фаза затухающего роста; V – стационарная фаза; VI – фаза от­мирания

На кривой явно видны не­сколько периодов (фаз) роста. Вначале после инокуляции пита­тельной среды живыми клетками продуцента отмечается период адаптации к новым условиям питания, так как клетке необходимо реорганизовывать свои микро- и макромолекулярные структуры. Такая реорганизация может включать синтез или подавление фер­ментов или структурных компонентов клетки: в этом периоде пе­рестраивается метаболизм клетки, синтезируются ферменты, не­обходимые для использования новых субстратов, активируется биосинтез белка. Этот период ферментации называют лаг-фазой. В процессе этой фазы клеточная масса может изменяться без изме­нения числа клеток (dx/d = 0). Лаг-фаза может быть короткой или достаточно длинной. Когда необходимая реорганизация кле­ток завершается, клетки входят в фазу роста, которая имеет не­сколько периодов.

Сначала протекает так называемый переходный период (фаза). Он наступает по достижении клеткой определенного объема и со­провождается делением клеток. Здесь происходит репликация ДНК, кариокинез, деление, в результате чего численность популя­ции увеличивается во времени.

Время между двумя последовательными делениями называется временем генерации. За это время число клеток в популяции удваи­вается. Если обозначить исходное число клеток С₀, тогда через данное число генераций n общее число живых клеток С_t, в культуре составит:

C_t = C₀  2ⁿ, (1.2.6)

Время генерации g можно определить по времени t, в течение которого образовалось данное число генераций n:

(1.2.7)

или

(1.2.8)

При условии, что число генераций за время t и время генера­ции известны,

(1.2.9)

или

(1.2.10)

В переходной фазе увеличение скорости роста, т. е. интенсивно­сти образования клеточной массы, достигает предела, после чего наступает третья фаза.

Экспоненциальная фаза характеризуется постоянной макси­мальной скоростью роста и поэтому иногда называется линейной фазой. На этом этапе идет быстрое размножение микроорганиз­мов, в обмен активно вовлекаются питательные вещества, генети­ческий аппарат клетки работает с наивысшей интенсивностью, наблюдается постоянная продолжительность возникающих друг за другом поколений клеток. Если на оси абсцисс отложить время (), а на оси ординат – число клеток (In N), то получится прямая зависимость (рис. 1.2.5).

Экспоненциальный рост в полулогарифмическом выражении:

(1.2.11)

Рис. 1.2.5 Экспоненциальный рост микробных клеток

где С_t – число клеток в любое, последующее после нулевой точки, время t, шт.; С₀ – число клеток в нулевой точке исчис­ления времени, шт.;  – удельная ско­рость размножения (роста), зависящая от концентрации субстрата, ч^-1:

(1.2.12)

где _mах – максимальная удельная ско­рость роста, ч^-1; [S] – концентрация пи­тательного субстрата; K_s – константа, со­ответствующая концентрации субстрата, при которой  = 0,5 _mах.

Таким образом, экспоненциальная фаза лимитируется содер­жанием питательных веществ. Если бы в идеальных условиях бак­терия, у которой время генерации g = 20 мин, находилась в экспо­ненциальной фазе 48 ч, то она бы дала потомство массой 2,210³¹ г, что в 4000 раз больше массы Земли. Обычно такой рост не поддерживается в популяции долгое время. Снижение концен­трации питательных веществ и накопление продуктов обмена, тормозящих рост и развитие, приводят к снижению скорости рос­та – наступает четвертая фаза.

Фаза затухающего роста характеризуется уменьшением скоро­сти размножения, увеличением продолжительности существова­ния следующих поколений клеток.

Стационарная фаза наступает, когда число клеток перестает увеличиваться. Общая численность популяции и масса живых клеток достигают своего максимума. В этот период могут суще­ствовать различные типы клеток: живые, но голодающие; живые, но ингибированные по причине отравления; клетки, менее устой­чивые к температуре и рН-среды; клетки меньшего размера. В этот период используются запасные питательные вещества клеток, распадаются некоторые рибосомы.

Фаза отмирания наступает, когда за счет автолиза биомасса клеток уменьшается. Процесс гибели клеток изучен недостаточно. Однако установлено, что угнетение и распад клеток обусловлены накоплением продуктов метаболизма и действием собственных ферментов (автолиз).

Принципиальной особенностью кинетики микробных популя­ций является зависимость скорости роста культуры от концентра­ции одного или нескольких компонентов среды, обеспечивающих биосинтетическую основу метаболизма, лимитирующих факторов. В микробиологических процессах важную роль играет любая фаза. Ценные первичные мета­болиты синтезируются в экспоненциальной фазе, в стационарной фазе образуются вторичные метаболиты (антибиотики, красящие вещества).

В экспоненциальной фазе прирост биомассы в единицу време­ни пропорционален концентрации клеток:

(1.2.13)

при этом скорость изменения числа клеток микроорганизмов:

N = N₀e^t, (1.2.14)

где N – число клеток после определенного времени роста, шт.; N₀ – число клеток посевного материала, шт.; е – основание натурального логарифма;  –удельная скорость роста культуры, ч^-1; t – продолжительность роста культуры, ч.

Удельная скорость роста культуры:

(1.2.15)

где Х₁ – концентрация биомассы в момент времени ₁ г/дм³; X₀ – концентрация биомассы в начале культивирования ₀ , г/дм³.

Удельная скорость образования продукта:

(1.2.16)

где P₁ – концентрация продукта в момент времени ₁ г/дм³; Р₀ – концентрация продукта в начале культивирования, ₀ , г/дм³.

Важным критерием оценки роста культуры является время, не­обходимое для удвоения биомассы, – продолжительность генера­ции:

(1.2.17)

Зависимость скорости роста культуры при периодическом культивировании от концентрации питательных веществ выража­ют уравнением, предложенным Жаком Люсьеном Моно (уравне­ние Моно, сходное с уравнением Л. Михаэлиса для ферментатив­ных реакций):

(1.2.18)

где _mах – максимальная удельная скорость роста, ч^-1; S – концентрация субстра­та, г/дм³; K_s – константа, характеризующая сродство продуцента к субстрату пи­тательной среды, соответствующая концентрации субстрата, при которой  = 0,5_mах, г/дм³.

Продуктивность периодических процессов выражается в г/(дм³ч). Расчет продуктивности ведут во все времена ферментации. Микро­организмы, для которых график зависимости  от S имеет большой наклон, обладают высоким сродством к лимитирующему субстрату. Если кривая пологая, то низким, в таких культурах большая доля остаточных концентраций субстрата.

Для количественной оценки _mах и К_s применяют график зави­симости 1/ от 1/S, т.е. график Лайнуивера-Берка. По точкам пересечения с осями координат находят искомые величины.

Если культивирование микроорганизма осуществляют с целью образования продукта (метаболита), то для расчета его количества используют уравнение:

P₁ – P₀ = G (S₀ – S₁), (1.2.19)

где P₀, P₁ – концентрация продукта в начальный период ферментации и через промежуток времени , г/дм³; G – коэффициент выхода продукта; S₀ и S₁ – кон­центрации лимитирующих веществ среды, г/дм³.

При культивировании микроорганизмов необходимо учиты­вать их генетические особенности, выражающиеся в способности расти и синтезировать различные продукты в данных условиях. Успешное развитие ферментационных способностей зависит, в первую очередь, как отмечалось выше, от получения высококаче­ственных штаммов, а во вторую – от знаний особенностей влия­ния параметров окружающей среды на рост и образование целево­го продукта.

Температура – один из основных факторов, регулирующих процессы ферментации. Рост микроорганизмов и образование продуктов являются результатом комплекса серий химических реакций. По­добно известным химическим реакциям эти показатели зависят от температуры. В таком случае рост можно описать уравнением:

(1.2.20)

или

(1.2.21)

где  – удельная скорость гибели клеток.

Следовательно, наблюдаемая удельная скорость роста (l/x) (dx/dt) является балансом роста и гибели. Обычно микроорганизмы растут, когда   , т.е. величи­ной  можно пренебречь. Ввиду того что  и , зависят от темпе­ратуры, целесообразно оценить оба параметра.

Наиболее типичные кривые зависимости роста от темпера­туры показаны на рис. 1.2.6 и соответствуют психрофильному, мезофильному и термо­фильному росту. Большинство микроорганизмов способны к росту при 20- 30 С, а также подпадают под какую-либо одну из трех категорий кривых. Микроорганизмы, рост кото­рых максимален при темпера­турах ниже 20 С, относятся к психрофилам, для мезофилов максимальный рост возможен при 30- 35 С, а для термофилов – при температуре выше 50 С. Об­щий вид кривых, изображенных на рис. 1.2.6, сходен.

Рис. 1.2.6 Влияние температуры на удель­ную скорость роста микроорганизмов: 1 – психрофилов; 2 – мезофилов; 3 – термофилов

При возраста­нии температуры до оптимального значения скорость роста при­мерно удваивается на каждые 10 С, затем она резко снижает­ся. Причину явления легко уста­новить, воспользовавшись гра­фиком Аррениуса (рис. 1.2.7).

Рис. 1.2.7 Зависимость удельной скорости роста микроорганизмов от температуры (график Аррениуса) : 1 – Enterobacter; 2 – Candida utili

Нисходящая часть кривой (температура выше оптимума) характеризует увеличение ско­рости гибели клеток. При этом как рост, так и гибель микроор­ганизмов могут быть описаны зависимостями Аррениуса [10, 12, 14, 15, 150, 156, 240, 337]:

(1.2.22)

(1.2.23)

где А и А' – константы; Е_а и Е_a' – энер­гия активации, Дж/моль; R – газовая постоянная, Т – абсолютная темпера­тура, К.

При выборе промышленных штаммов микроорганизмов в производ­стве пищевых продуктов большое значение имеют биохимические свойст­ва микроорганизмов [88]. Согласно известным фактам, все бифидобактерии сбраживают глюкозу, галактозу и фруктозу, все штаммы, выде­ленные от людей, сбраживают лактозу и ее изомер лактулозу. При этом важен состав образующихся продуктов.

Известно, что молочнокислые микроорганизмы по характеру сбра­живания углеводов делят на гомоферментативные, которые превращают глюкозу в молочную кислоту почти количественно (90 %), и гетероферментативные, превращающие её в смесь молочной кислоты (50 %), этанола и углекислого газа – СО₂. В процессе бифидоброжения также образуется мо­лочная кислота, которая является основным конечным продуктом. При этом, согласно данным И.С. Хамагаевой, бифидобактерии продуцируют только L(+) молочную кислоту, используемую организмом человека в различных физиологических процессах [402]. В этом отношении бифидобактерии превосходят некоторые молочнокислые микроорганизмы, кото­рые, наряду с L(+), продуцируют L (-) молочную кислоту, не усваиваемую организмом.

Вместе с тем, следует отметить, что суммарное уравнение бифидоб-рожения имеет особый характер и не соответствует ни гомо-, ни гетеро-ферментативному молочнокислому брожению. В результате сбраживания глюкозы образуется лактат и ацетат:

2 глюкозы  2 ацетата + 2 L-лактат

В работах зарубежных авторов последних лет показано, что в про­цессе бифидоброжения происходит восстановление пировиноградной ки­слоты до молочной, или её разрушение до уксусной и муравьиной кислот, с образованием этилового спирта. Это зависит от состава питательной сре­ды и штамма бактерий [35]. В качестве важных промежуточных продуктов реакции броже­ния следует назвать фруктозо-6 фосфат, обладающий высокими редуци­рующими свойствами, и янтарную кислоту.

Органическим и жирным кислотам, образующимся в процессе брожения, отводится важная роль в формировании качества бифидосодержащих пищевых продуктов. Органические кислоты способствуют ингибированию развития нежелательной микрофлоры при хранении продуктов, формированию вкусовых характеристик, консистенции. Как о частном случае, следует говорить об их участии в создании условий для восста­новления нитрита натрия и взаимодействии продуктов реакции с мышеч­ными пигментами (миоглобином и гемоглобином), следствием чего явля­ется формирование устойчивой окраски, присущей мясопродуктам. Технологическое значение жирных кислот заключается в участии их в процессе формирования вкуса и аромата.

Протеолитическая активность микроорганизмов, в том числе бифидобактерий, имеет важное значение. Знания по этому вопросу важны с нескольких позиций.

Во-первых, на основании протеолитической активности можно су­дить о преимущественной потребности изучаемых микроорганизмов в тех или иных азотистых веществах (азот полипептидов, низкомолекулярных пептидов, аминоаммиачный) и наборе аминокислот, а, следовательно, про­гнозировать возможность и интенсивность их роста в различных белковых средах, создавать необходимые условия культивирования или роста мик­роорганизмов.

Во-вторых, от протеолитической активности зависит формирование органолептических свойств продуктов, в том числе вкуса, аромата, консистенции. Это объясняется тем, что многие из образующихся аминокислот обладают вкусо-ароматическими характеристиками, а также являются предшественниками веществ, отвечающими за это качество, например, продукты реакции меланоидинообразования. Влияние на консистенцию обусловлено тем, что одной из функций белков в продуктах является структурообразование. В-третьих, от протеолитической активности микроорганизмов зави­сят биологическая ценность ферментированных ими продуктов и их дос­тупность пищеварительным ферментам [176].

В литературе достаточно широко представлены данные о протеоли­тической активности ферментных систем молочнокислых микроорганиз­мов. Вместе с тем, это не исключает новых исследований по оценке фер­ментативной активности ввиду изменчивости микробиальных культур.

Одним из перспективных направлений переработ­ки молочной сыворотки является ее ферментация различными видами полезных микроорганизмов с целью дальнейшего использования в производстве лечебно-профилактических, диетических и тонизирующих напитков, кормовых добавок.

Рядом учёных установлено, что наи­более активное кислотообразование в различных ви­дах молочной сыворотки происходит при развитии культур заквасок L. acidophilus, L. bulgaricus и S. thermophilus (1:1), L. bulgaricus и S. thermophilus (1:1) и бакконцентрата БК-Углич-ТП. Наиболее благоприятной средой для культивирования указанных заквасочных культур является смесь творожной и термокислотной сыво­роток в соотношении 1:1, а также в большинстве слу­чаев – термокислотная сыворотка [174, 181, 432].

Ферментативные процессы основаны либо на об­работке биологических материалов, являющихся их естественными компонентами, либо на внесении в биологические материалы свободных ферментов, выделенных ранее из тканей и клеток животных, растений и микроорганизмов. Обе группы фермен­тативных процессов можно описать математически.

Математическое описание ферментативных про­цессов можно проводить с точки зрения, как их ста­тики, так и кинетики.

Статика ферментативных процессов выражается определяемым стехиометрическим балансом концен­траций (массовых долей реакционной системы) сво­бодных и связанных реагентов, фермента и продуктов ферментативной реакции, а также равновесными со­отношениями этих концентраций для ПС ферменти­руемого компонента и фермента. Баланс массы для процесса в целом, для начального, текущего и равно­весного состояния системы можно записать в виде:

С_рн + С_фн = С_р + С_ф + С_пс + С_п + С_р' + С_ф' + С_пс' + С_п', (1.2.24)

где С_рн, С_п, С_р'; С_фн, С_ф, С_ф'; С_пс, С_пс'; С_р, С_п' – начальные, текущие, конечные и равновесные значе­ния массовых долей ферментируемого компонента, фермента, ПС и продукта ферментации.

Кинетика ферментативного процесса определяет скорости изменения концентраций свободного или связанного фермента, а также продуктов фермента­тивного процесса.

Продолжительность этапов ферментации может быть определена из уравнений химической кинетики. Первым (индукционным) этапом в расчетах обыч­но пренебрегают ввиду его кратковременности и ма­лой скорости процесса. Скорость второго, также кратковременного, этапа может быть выражена урав­нениями скорости перехода свободного фермента в связанное состояние при одновременном распаде ра­нее образованного ПС на свободный фермент и про­дукты ферментации:

К₁С_рнС_ф' = К₂С_рн (С_фн – С_ф"), (1.2.25)

где К₁ и К₂ – коэффициенты скоростей образования и распада ПС; С_фн и С_ф" – начальные и конечные для второго этапа значения концентрации свободного фермента. Концентрация ферментируемого компо­нента ввиду незначительного ее изменения на дан­ном кратковременном этапе принята постоянной, равной С_рн.

Из условия (2) может быть вычислена концентра­ция свободного фермента в конце второго и на про­тяжении третьего этапов:

(1.2.26)

Уравнение скорости второго этапа ферментации:

(1.2.27)

где Л – стехиометрический коэффициент.

При начальном ( = 0; С_ф = С_фн) и конечном ( = к, С_ф = С_ф") условиях продолжительность вто­рого этапа:

(1.2.28)

Из соотношения масс Л = М_p/М_ф ферментируе­мого компонента М_p продукта ферментации этого соединения следует уравнение скорости третьего этапа ферментации, которая выражена скоростью уменьшения концентрации ферментируемого ком­понента:

(1.2.29)

Пренебрегая малым количеством ферментируемо­го компонента, перешедшего в ПС на втором этапе при условии его избыточности, и приняв С_p = С_pн при '" = 0, а также С_р' = f (C_ф") для конца третьего этапа, получим уравнение его продолжительности:

(1.2.30)

Для завершающего четвертого этапа скорость ос­вобождения фермента из остатка ПС, условно выра­женная скоростью изменения концентрации фер­ментируемого компонента, равна:

(1.2.31)

С учетом начального и конечного условий для этой стадии (при ''" = 0, C_ф = 0, ''" = _к''", С_ф = С_фн) продолжительность этапа:

(1.2.32)

Таким образом, последовательность математичес­ких описаний процессов даст возможность оптими­зировать биоферментативные процессы, как первой, так и второй группы [170].

Л.А. Остроумов, A.M. Осинцев провели теоретическое и экспериментальное исследование процессов, лежащих в основе свёртывания молока. На основе использования и анализа экспериментальных данных ими разработаны математические модели, позволяющие управлять данным процессом с целью совершенствования и развития технологий переработки молока [250, 255, 256, 258].

И.С. Хамагаева и М.Б. Данилов теоретически обосновали и практически использовали в разработке технологии пробиотических продуктов ферментный препарат β-галактозидазу [92, 402].

И.А. Смирнова исследовала биотехнологические и физико-химические особенности термокислотного свертывания молока. На основе математического анализа экспериментальных данных было дано теоретическое обоснование технологии формирования сыров с термокислотной коагуляцией белков молока [351, 352, 353].

Н.И. Дунченко, Г.Н. Румянцева разработали теорию и практическое использование направленного биокатализа в технологии пищевых продуктов, а также ингредиентов белковой и углеводной природы [338].

Помимо биохимических процессов, при ферментации протекают физико-химические: коагуляция казеина и гелеобразование [86].

Свертывание молока, выражающееся в образовании геля, является результатом ряда физико-химических изменений, происходящих на мицеллярном уровне. Механизмы, предлагаемые для объяснения процесса образования сгустка, диаметрально отличаются друг от друга в зависимости от того, идет ли речь о кислотном свертывании или свертывании с помощью молокосвер-тывающих ферментов [308].

Быстрое свертывание молока путем введения в него минеральной или ор­ганической кислоты влечет за собой флокуляцию казеина при рН 4,6 в виде более или менее зернистого осадка, отделяющегося от молочной сыворотки. Напротив, постепенное подкисление, достигаемое либо с помощью молочно­кислого брожения, либо гидролизом гликолактонов, ведет к образованию прочного однородного сгустка, занимающего тот же объем, что и использо­ванное для его приготовления молоко.

Кроме ферментных систем микроорганизмов, в данном процессе участвует большое количество протеолитических ферментов животного, растительного или микробного происхождения, обладающих способностью ко­агулировать казеиновый комплекс [462, 470, 503].

Хаммарстен (Hammarsten) выделял в процессе свертывания два этапа, первый из которых, соответствующий фазе специфического воздействия фер­мента, вызывает ограниченный протеолиз с выделением протеозов (5 % ка­зеина) и образованием параказеина в кальциевой среде.

В тридцатые годы двадцатого века Линдерстром-Ланг (Linderstrom-Lang) и Хольтер (Holter) предложили теорию, согласно которой устойчи­вость казеинового комплекса молока обеспечивается благодаря присутствию определенного компонента, играющего роль стабилизатора. В процессе пер­вичной фазы коагуляции сычужный фермент расщепляет именно этот компо­нент, а во второй ее фазе происходит флокуляция дестабилизированного ка­зеинового комплекса.

Более поздние работы Ничмана, Алеса и Гарнье (Nitschmann, Alais, Gar-nier) подтвердили, что свертывание молока сычужным ферментом действи­тельно происходит в две фазы:

• первичная ферментативная фаза характеризуется тем, что сычужный фермент расщепляет стабилизирующий компонент казеиновой мицеллы – χ-казеин; этот процесс сопровождается выделением пептида (казеиномакропептид);

• вторичная фаза коагуляции соответствует образованию геля и агрегиро­ванию измененных под действием фермента мицелл.

Обе вышеуказанные фазы могут быть представлены в виде двух следу­ющих уравнений [451]:

E + S ↔ ES → E+P+C; (1.2.33)

(1.2.34)

в которых Е, S, Р и С соответственно обозначают фермент, субстрат, пара-казеин и казеиномакропептид, a k_s – константу скорости агрегирования параказеина.

В количественном выраже­нии активность фермента условно определяют по начальной ско­рости ферментативной реакции. Начальная скорость зависит от многих факторов, наиболее важные из них – температура, кон­центрация субстрата, рН реакционной смеси и время от начала реакции. Поэтому по предложению Комиссии по ферментам Международного биохимического союза были приняты правила определения активностей препаратов и их выражения в единицах активности.

В живых системах ферменты способны длительно работать без потери активности. В искусственных условиях ферментные пре­параты после одноразового использования обычно инактивируются, при этом обрабатываемый материал загрязняется препаратом. Поэтому были созданы новые формы ферментных препаратов многократного использования. Наибольшее распространение по­лучили препараты, в которых ферменты в активной форме при­креплены к нерастворимой основе. Такие ферментные препара­ты называются в литературе по-разному: связанные, пришитые, фиксированные, матрицированные, прикрепленные, но чаще все­го их называют иммобилизованными [135].

Таким образом, всё вышеизложенное позволяет считать целесообразным проведение экспериментальных и аналитических исследований по определению факторов, позволяющих повысить эффективность процесса ферментации молочных и молокосодержащих сред.