1.3 Культуры, используемые в молочной промышленности для ……. Производства ферментированных молочных и молокосодержащих …….. Продуктов

Культуры в узком смысле – это разведение штамма микроорганизмов на том или ином субстрате. Термин "культура" употребляется и в широком смысле. Культурами называют не только отдельные штаммы, но и смеси штаммов или видов, а также суспензий вегетативных клеток или размноженные клетки микроорганизмов, если их используют для изготовления определенных молочных продуктов и они не содержат микроорганизмов других видов. В данном случае термины "культура" и "закваска" равнозначны. Закваски и чистые культуры должны отвечать определенным требованиям.

Все микроорганизмы, встречающиеся в молоке и молочных продук­тах, можно разделить в зависимости от их роли в формировании качества продукции на три основные группы: технически важная микрофлора, патогенные и санитарно-показательные микроорга­низмы. К первой группе относится микрофлора заквасок и технически вредная микрофлора, вызывающая пороки молочных продуктов [372].

Заквасочные бактерии выполняют три важных функции:

• гликолиз – преобразование лактозы в молочную кислоту; образование кисло­ты исключительно химическим путем (например, через глюконо- δ-лактон) в совре­менных условиях не может должным образом заменить активность заквасок; исклю­чение составляют мягкие сыры, такие как коттедж;

• протеолиз – расщепление белковых цепей на более простые вещества, такие как пептоны, пептиды и аминокислоты;

• липолиз – превращение жирных кислот молочного жира в кетокислоты, кетоны и сложные эфиры, некоторые из которых обусловливают вкус и запах [348].

Закваски, применяемые при про­изводстве кисломолочных про­дуктов, можно классифициро­вать: по способу производства (жидкие, в том числе замороженные, сухие); содержанию молочнокислых мик­роорганизмов (закваски, бактериальные концентраты); составу микрофлоры (моновидовые, поливидовые, симбиотические); назначению (группы продуктов); способу использования (приготов­ление производственной закваски, пря­мое внесение).

При подборе микроорганизмов в состав закваски учитываются следующие факторы: специфические свойства вы­рабатываемого продукта, температур­ные режимы производства, взаимоот­ношения между микроорганизмами, возможность развития бактериофага.

В зависимости от количества видов микроорганизмов, входящих в состав закваски, их можно разделить: на моновидовые, содержащие не­сколько штаммов одного вида микро­организмов; поливидовые, стимулирующие раз­витие друг друга (S. termophilus и L. bulgaricus); и инди­видуального развития (молочнокислые и пробиотические) – искусственный ценоз; симбиотические – естественные поливидовые микроорганизмы, актив­но стимулирующие друг друга, – есте­ственный ценоз [26].

Закваски и чистые культуры должны отвечать определенным требованиям. В то время как для сквашивающих культур име­ются всеобъемлющие, хотя и не единые требования, критерии качества, для других групп культур они еще частично отсут­ствуют. Ниже, по возможности полно представлены важные для заквасок и чистых культур требования к их качеству (табл. 1.3.1) [444, 459, 519].

Важным показателем качества для каждой вновь разработанной закваски (культуры) является ее пригодность для по­ставленных целей, что должно быть проверено исследованиями в производственных условиях [227].

Молочнокислые бактерии, развиваясь в природных и производст­венных субстратах, вступают в сложные взаимоотношения с дру­гими микроорганизмами. Существенную роль играет видовая принад­лежность совместно развивающихся микроорганизмов и даже их штаммы.

Таблица 1.3.1

Требования к качеству заквасок и чистых культур

Наименование	Характеристика
1	2
Рост	Требования к питательным веществам. Скорость размножения, максимальное количество микроорганизмов. Спектр температур, диапазон кислотности. Симбиоз, метабиоз. Стимулирующее воздействие, стимулируемость. Равновесие между штаммами. Морфология (микроскопическая, макроскопическая картина). Пигментообразование
Биохимическая активность	Гликолиз Протеолиз Липолиз Образование ароматических веществ Причины порока аромата

Продолжение табл. 1.3.1

1	2
Устойчивость к неблаго­приятным воздействиям	Химикалии Антибиотики, в том числе лечебные препараты Пестициды, гербициды Тормозящие вещества других микроорганизмов Другие тормозящие факторы (например, из корма) Бактериофаги
Чистота	Количество посторонних микроорганизмов, аэробных и анаэробных спорообразующих бактерий, колиформ, дрожжей, плесневых грибков, стафилококков, саль­монелл, других патогенных бактерий
Органолептические показатели	Консистенция Газообразование Способность к образованию аромата и пороки аромата

Направленность взаимоотношений в большей степени определяется условиями среды обитания и может изменяться в процессе развития микроорганизмов [155].

Одним из важных свойств, помимо изложенных выше, присущих как молочнокислым, так и бифидобактериям, является антагонистическая активность [433, 445, 449, 456]. Достижения исследований последних десятилетий в области изучения антагонистической активности достаточно полно описаны Е.И. Квасниковым [155]. Он объясняет это свойство двумя факторами: продуцированием молочной кислоты, подавляющей рост патогенной и условно патогенной микрофлоры и специфическим действием антибиотиков, продуцируемых бактериями.

Так, S. lactis, например, выделяет низин, S. cremoris – диплококцин, L. acidophilus – ацидофилин и лактоцидин, Lactobacillus plantarum (далее L. plantarum) – лактолин, Lactobacillus brevis (далее L. brevis) – бревин [296, 529].

Антагонистические свойства ацидофильной палочки обусловлены как продуцируемой ею молочной кислотой, так и антибиотиками [99, 300, 526]. Среди её антибиотических веществ описаны ацидофилин, накапливающийся в период максимальной жизнедеятельности культуры и лактоцидин, синтезирующийся позже. Ацидофилин термостабилен, проходит через мембранные фильтры, максимум активности проявляет при рН 5,0-5,6.

Из фильтратов двухсуточных культур ацидофильной палочки выделен и антибиотик, угнетающий развитие Candida albicans. Это вещество растворимо в воде, адсорбируется активированным углем в нейтральной или кислой среде и разрушается в течение 20 мин при 110 С, устойчиво при комнатной температуре. Возможно, ацидофильная палочка ограничивает развитие этих микроорганизмов в организме человека и животных [472, 487]. Ацидофильная палочка проявляет антагонизм по отношению к ряду возбудителей желудочно-кишечных заболеваний. Степень её антагонизма зависит от состава питательной среды [468, 469].

Кодама установил, что L. plantarum образует антибиотик лактолин. Впоследствии было найдено, что L. plantarum, выделенные из разнообразных источников (молочных продуктов, силосов и т.д.), задерживают рост Clostridium tyrobutiricum, Saccharomyces carlsbergensis, Candida albicans [87, 487, 499].

Ряд авторов обнаружили, что L. casei обладает антагонистическими свойствами по отношению к кишечной и сенной палочкам, пиогенному микрококку, к бактериям тифа и дизентерии [495, 501]. Так, Нери [501] нашел, что максимум антибиотической активности L. casei приходится на 11-13 сутки, а нейтрализованная культуральная жидкость L. casei не угнетает рост Brucella melitensis. Мазек [495] утверждает, что L. casei, выделенная из молока, активнее подавляет развитие кишечной палочки, чем L. bulgaricus и L. helveticus. Есть данные о способности L. casei подавлять развитие Candida albicans [487].

Понятием "биотрансформация" или "биопревращения" охватываются процес­сы, при которых микроорганизмы превращают вещества в определенные продукты, структура которых связана со структурой исходных веществ. Такие процессы в отличие от многостадийных реакций ферментации имеют дело только с одной или ограниченным числом реакций, катализируемых ферментами. Процессы биотрансформации могут осуществляться с помощью растущих или по­коящихся клеток и спор, а также клеток, высушенных с применением воздуха или ацетона. Известны тысячи процессов биопревращений, к ним относятся такие, как гидроксилирование, гидролиз, метилирование, конденсация, декарбоксилирование, амидирование, рацемизация, эпоксидирование, окисление, этерификация, деметилирование, гидрирование, аминирование, фосфорилирование, изомеризация, восстановление и др. [397].

Для того чтобы клетки обладали наилучшими качествами для конкретного процесса биотрансформации, в них должно присутствовать максимальное коли­чество нужных для этого ферментов. Следовательно, необходима регуляция синтеза клеток [116, 167, 363, 380, 493].

Большинство молочнокислых бактерий для своего развития остро нуждаются в ряде витаминов и аминокислот. Различные виды молочнокислых бактерий могут вступать между собой не только в антагонистические, но и симбиотические взаи­моотношения (Nurmikko, 1959 г.; Devoyod, Desmazecaud, 1970 г., и др.). Например, при исключении некоторых факторов роста (вита­минов группы В и аминокислот), необходимых для двух штаммов, из полноценной в иных отношениях синтетической среды, оба ор­ганизма могли расти в симбиозе, так как каждый из них продуци­ровал биологически активные вещества, используемые другим. Так, L. arabinosus 17-5 (требует фенилаланин) и S. faecalis R (требует фолиевую кислоту, треонин, гистидин, серин или глицин) растут в симбиозе, когда фенилаланин, треонин и фолиевая кисло­та или фенилаланин и гистидин, или фенилаланин, серин и глицин опущены из среды. Аналогичные наблюдения были сделаны и при выращивании L. fermenti ATCC 9338 (требует фенилаланин) и S. faecalis R в среде без фолиевой кислоты и фенилаланина (Nurmikko, 1959).

Молочнокислые бактерии при дефиците в среде ростовых фак­торов могут расти в ассоциациях, включающих до шести компо­нентов. Указанное явление обусловливается тем, что культуры молочнокислых бак­терий выделяют в среду отдельные ростовые вещества (фенилаланин, пролин, треонин, гистидин, глицин, фолиевую и фолиновую кислоты, витамин В₁₂) и взаимно дополняют потребность в них друг друга [6, 28, 155].

Стимуляция роста молочнокислых бактерий при обогащении среды различными естественными добавками, такими как дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт, экстракты поджелудочной железы, печени, объясняется повышением содержания в среде аминокислот, пуриновых и пиримидиновых соединений, витаминов и других соединений. Перспективной основой среды для накопления молочнокислых бактерий при производстве бактериальных концентратов является молочная сыворотка. В качестве стимулятора роста используют кукурузный экстракт, содержащий азотистые вещества (полипептиды, аминокислоты), витамины группы В (рибофлавин, пантотеновая кислота, пиридоксин) и мине­ральные вещества (калий, железо, магний, фосфор) [7, 28, 29, 505].

В настоящее время широко используется способ хра­нения мяса, мясных и молочных продуктов в заморо­женном виде, поэтому важно знать, какие изменения происходят с микроорганизмами при замораживании и хранении продуктов. Исследованиями многих авторов установлено, что устойчивость микроорганизмов к замораживанию зави­сит от ряда факторов: температуры и скорости замораживания; состава среды, в которой происходит замора­живание; кратности замораживания; вида микроорга­низмов и их физиологического состояния [218, 240, 242, 354, 412, 443, 447].

Все факторы внешней среды, оказывающие большое влия­ние на развитие микроорганизмов, можно разделить на три основные группы: физические, химические и биологические. Из физических факторов наиболее важное значение имеют влажность, концентрация веществ, температура, радиация, свет; из химических – реакция среды и окислительно-восстановительные условия в ней; из биологических – антимикробные веще­ства. Существует тесная взаимосвязь между многими факторами окружающей среды и измене­ние одного из них часто меняет реакцию микроорганизма на действие других факторов [219].

Исключительную роль в рациональном питании играют кисломолочные продукты, служащие важным фактором профилактики и лечения различных желудочно-кишечных и других заболеваний. Лечебная и диетическая ценность молочных продуктов объясняется накоплением в них антимикробных веществ в результате жизнедеятельности молочнокислых бактерий. Вместе с тем, они обладают приятными вкусовыми качествами, удовлетворяющими любого потребителя. Накопле­ние в молоке целого ряда веществ, формирующих характерные для данно­го продукта органолептические свойства, во многом зависит от видового состава микроорганизмов закваски и биохимической активности, входящих в неё культур [175].

Г.Б. Пищиков и Н.В. Пеньков предположили, что кинетические уравне­ния, описывающие процесс роста, размножения и гибели микроорганизмов, наиболее просто форму­лируются для свободных пространственно-однород­ных систем, когда клетки равномерно распределены по объему.

В этом случае получены следующие кинетические уравнения, описывающие рассматри­ваемый процесс:

(1.3.1)

(1.3.2)

(1.3.3)

где U_(x,t) – скорость роста клеток; Г_(x,t) – коэффициент смертности; D_c(x,t) – стохасти­ческий параметр (коэффициент диффузии в прост­ранстве масс); С(t) – концентрация лимитирующего субстрата в культуральной жидкости в момент време­ни t; (C,t) – удельная скорость поступления в систе­му микроорганизмов массой х₀, образовавшихся при делении клеток массой 2х₀; х₀ – начальная масса клетки; ... – знак среднего значения указанной ве­личины; δ(z) – δ-функция Дирака от z; Y – экономи­ческий коэффициент; – масса жизнеспособных клеток в единице объема сис­темы в момент времени t; – масса мертвых, не способных к делению клеток в единице объема биореактора в момент времени t.

Г.Б. Пищиковым и Н.В. Пеньковым аналитически показано, что при гибели клеток микроорганизмов в процессе роста существует пороговая минимальная концентрация субстрата (С = С*), ниже которой клеточный рост невозможен. В этом случае при малых концентрациях субстрата репликационный процесс идет настолько медленно, что инактивационные процессы успевают блокировать рост клеток [296].

Пробиотические продукты, содержащие бифидобактерии, являются одной из важнейших составляю­щих функционального питания. Лиофилизированные бактериальные препараты с бифидобактериями, имеющие высокую концентрацию данных микроор­ганизмов в биологически активном состоянии, – это необходимый материал для промышленного произ­водства пробиотических продуктов в молочной и других отраслях пищевой промышленности [442].

Известно, что микроорганизмы в питательных средах наиболее интенсивно растут в фазе экспонен­циального роста. Результаты исследований, прове­денных во ВНИМИ в 2002-2005 гг., свидетельству­ют о том, что рост молочнокислых микроорганизмов и би­фидобактерий в молоке и молочных питательных средах протекает преимущественно в фазе линейно­го роста, для которой характерно относительное по­стоянство скорости роста микроорганизмов [208].

Мощным пребиотическим фактором для бифидобактерий служит лактулоза, широко используемая как профилактиче­ское и терапевтическое средство, особенно в случаях формирования дисбиотических явлений [407].

В Московском государственном университете прикладной биотехнологии ведущими учёными страны в области биотехнологии И.А. Роговым, Е.И. Титовым, Н.В. Нефедовой, В.И. Ганиной и др. ведутся работы по селекции и исследованию штаммов молочнокислых бактерий, обладающих комплексом технологических, пробиотических и специфических свойств, с целью дальнейшего их использования в промышленности [59, 60, 62, 307].

Исследования взаимоотношений пробиотических штаммов, характеризующихся высокой антагонистической активностью к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, а также термофильных молочнокислых стрептококков (S. thermophilus) показали, что они сочетаются между собой, а созданные консорциумы целесообразно использовать при получении комплексных добавок [60, 238, 362].

При разработке консорциумов пробиотиков необходимо обеспечить условия, позволяющие им вступать в симбиотические отношения, характер которых зависит от таксономических принадлежности бактерий, условий культивирования, скорости адаптации к ней, активности роста микроорганизмов, также способности продуцироваться конкретными штаммами бактерий различных продуктов метаболизма [62, 327]. При этом существенное значение имеет не только выбор культур, у которых в большей степени наблюдается проявление физиологической активности, но и их сочетание с другими компонентами.

При выборе культур и заквасок для производства продуктов функционального питания, особенно бифидобактерий необходимо учитывать свойства и поведенческие реакции на состав питательных веществ в среде обитания, в том числе бифидогенные факторы, стимулирующие рост и развитие бифидобактерий.

Создавая пробиотики и продукты функционального питания, со­держащие живые бифидобактерии с определенным лечебно-профилак­тическим воздействием на организм человека, невозможно подобрать какой-нибудь один штамм, который в естественных условиях мог бы одновременно эффективно ингибировать рост кишечных патогенов, ас­симилировать холестерол и оксалаты, гидролизовать лактозу, проявлять антиопухолевую и антиаллергическую активность и т.д. Кроме того, подбирая культуры бифидобактерий для промышленного производства вышеуказанных препаратов и продуктов питания, всегда следует иметь в виду, что штаммы, предназначенные для производства, должны содер­жать клетки, достаточно устойчивые к низкому рН, к желчным кислотам.

После того, как в середине 1960-х годов группа немецких иссле­дователей установила, что бифидобактерии можно при определенных условиях культивировать в молоке, началась история использования этих микроорганизмов для приготовления не только фармакопейных препаратов, но и ферментированных молочных и молокосодержащих продуктов.

Подавляющее большинство продуктов функционального питания на основе бифидобактерий готовятся на производственных штаммах, принадлежащих к видам Вifidobacterium bifidum (далее B. bifidum), В. longum, B. lactis, B. breve, В. infantis, В. аnimalis, В. adolescentis [441].

Н.Б. Гавриловой разработаны принципы конструирования поликомпонентных заквасок на основе совместного использования лакто- и бифидобактерий, а также новые технологии комбинированных кисломолочных продуктов с функциональными свойствами, при разработке которых в полной мере учтены все факторы, включая бифидогенные свойства пищевых волокон растительного происхождения [43].

Анализ состояния подбора и использования пробиотических микроорганизмов для производства молочных и молокосодержащих продуктов позволяет считать необходимым проведение специальных исследований по активизации и защите культур в сложной питательной среде молокосодержащих продуктов.