3.1.2. Кинетика ферментативных реакций с двумя субстратами

Ферменты катализируют, как правило, реакции с участием двух субстратов. Односубстратные реакции в большинстве случаев являются частным случаем двусубстратных, протекающих в режиме большого избытка одного из компонентов реакции. Например, гидролитические реакции протекают при постоянном избытке воды, и в силу этого реакции имеют кажущийся односубстратный характер. При анализе механизмов многосубстратных реакций полезную информацию дает исследование зависимостей скоростей реакции от концентрации всех субстратов. Эти зависимости позволяют определить механизмы и получить определенную информацию о возможной последовательности стадий.

В реакции с двумя субстратами участвуют: активный центр фермента E , субстрат S₁ , субстрат S₂. При этом возможны два принципиально разных механизма реакции.

1. Активный центр фермента последовательно образует комплексы с первым и вторым субстратами; лимитирующей стадией является реакция, протекающая в тройном комплексе:

,

.

2. Стадии взаимодействия субстратов с активным центром фермента разделены каким-либо необратимым химическим превращением (пинг-понг механизм):

,

.

Происходит образование комплекса активного центра с первым субстратом S₁, за этим следует его химическое превращение с образованием интермедиата X. Второй субстрат S₂ реагирует необратимо с фермент-субстратным комплексом.

Из экспериментальных данных можно определить механизм реакции. Для этого исследуют зависимости скорости реакции от концентрации одного субстрата при постоянной концентрации второго субстрата. Проводят серию опытов, в каждом из которых изменяют концентрацию одного субстрата (например, первого), оставляя концентрацию другого (второго в нашем примере) в этой серии постоянной. Фиксируют полученную скорость реакции при этом. Затем проводят следующую серию опытов, где тоже изменяют концентрацию первого субстрата, оставляя концентрацию второго постоянной, но эта концентрация второго субстрата будет уже другой, не такой, как в первой серии.

Для механизма с образованием тройного комплекса экспериментальные данные будут давать серию пересекающихся прямых (рис. 3.3 и 3.4), а для пинг-понг механизма графики зависимости скорости реакции от концентрации в двойных обратных координатах будут представлять параллельные прямые (рис. 3.5 и рис. 3.6).

Рассмотрим, как получается кинетическое уравнение процесса на примере ферментативной реакции, протекающей по пинг-понг механизму.

Рассмотрим вывод кинетического уравнения для пинг-понг механизма. Для удобства приведем еще раз схему процесса:

,

,

где − константы скорости прямой и обратной стадий обратимой реакции образования комплекса фермент  первый субстрат;

− константа скорости необратимой реакции химического превращения комплекса в ;

− константы скорости прямой и обратной стадий обратимой реакции образования комплекса − второй субстрат;

− константа скорости реакции образования продукта и высвобождения фермента.

Обозначим:  равновесные концентрации фермента, первого субстрата и комплекса активный центр фермента  первый субстрат; − равновесные концентрации интермедиата X, второго субстрата и комплекса интермедиата X со вторым субстратом.

Самая медленная (лимитирующая) стадия процесса по данному механизму последняя, поэтому скорость всего процесса будет равна

.

Для того чтобы найти выражение для концентрации интермедиата , воспользуемся условием стационарности по и по .

Скорость накопления интермедиата равна

,

.

Скорость накопления интермедиата равна

.

Далее получим

,

.

Реакцию образования фермент-субстратных комплексов и можно охарактеризовать константами диссоциации этих комплексов:

, .

Учитывая соотношения между константами скоростей прямой и обратной стадий обратимой реакции и константой равновесия этой реакции, а также то, что константа скорости последней стадии самая маленькая, получим:

,

.

С другой стороны, уравнение материального баланса по ферменту имеет вид

,

или

.

Выражая и приняв допущения, что , а , получим окончательное выражение для кинетического уравнения:

,

или это же уравнение, представленное для удобства дальнейшего анализа:

, (3.9)

где − комбинация констант скоростей различных стадий ферментативной реакции.

Уравнение (3.9) представляет собой уравнение Михаэлиса для двусубстратной ферментативной реакции, протекающей по пинг-понг механизму. Графическая обработка экспериментальных данных в двойных обратных координатах по этому уравнению позволит определить кинетические параметры. В частности, можно найти эффективные константы Михаэлиса. Здесь они будут представлять собой набор констант и зависеть также от концентрации одного из субстратов. Например, проводится серия опытов, в которых постоянна концентрация первого субстрата, а варьируется концентрация второго. Тогда уравнение (3.9) можно представить в виде

,

или , .

Проводя серию опытов с постоянным значением концентрации второго субстрата и варьированием концентрации первого, можно получить эффективную константу Михаэлиса по первому субстрату:

.

Эти константы легко находятся графической обработкой экспериментальных данных в двойных обратных координатах. В принципе можно найти и каждую из констант скоростей отдельных стадий, однако для этого нужно проводить дополнительные исследования, в частности по релаксационной кинетике. Эта отдельная тема кинетики ферментативных реакций, которая не входит в материал данного учебного пособия.