3.3.2. Типовое задание и алгоритм выполнения курсовой работы
1. Запишите дифференциальное кинетическое уравнение, характеризующее скорость изменения концентрации этанола в жидкости тела. Проинтегрировав его, получите уравнение кинетической кривой для спирта в жидкости тела для случая с нулевым порядком кинетического уравнения элиминации спирта. Выведите теоретически уравнения для расчета координат максимума (максимальная концентрация, время достижения максимума).
2. Постройте эту кинетическую кривую (первоначально с шагом по времени 5 мин в течение 1 ч и с шагом 20 мин в дальнейшем) для женщины (масса тела 65 кг), которая натощак выпила 100 мл коньяка. Найдите координаты максимума кривой опьянения графически и теоретически.
3. На рисунок, построенный в п. 2, нанесите кинетическую кривую при удвоенной дозе спиртового напитка (полагая, что его тоже выпили практически сразу).
4. На этот же рисунок нанесите линию (другим цветом), показывающую уровень алкоголя в крови, соответствующий начальному пределу легкой степени опьянения. Проанализируйте полученный рисунок.
5. Рассчитайте теоретически время, которое потребуется для снижения концентрации этанола в крови человека практически до нуля (т.е. время похмелья) для каждой кинетической кривой.
6. Перечислите факторы, влияющие на продолжительность периодов резорбции и элиминации.
7. Рассчитайте количество пива, которое эта женщина может выпить, чтобы достичь такой же максимальной концентрации спирта в крови, как и при принятии коньяка (первоначальная доза).
8. Изобразите еще раз кинетическую кривую концентрации алкоголя в жидкости тела человека, употребившего единовременно двойную дозу алкоголя (на новом рисунке). На этот же рисунок нанесите линию для случая, когда это же количество алкоголя употреблено равными порциями в течение 1 ч с 15-минутными перерывами. Прокомментируйте влияние такой тактики приема алкоголя на период опьянения.
9. Запишите общую схему метаболизма этанола, назовите вещества, участвующие в этой схеме, укажите лимитирующую стадию всего процесса.
10. Напишите подробный ряд реакций, описывающий механизм окисления этанола до ацетальдегида, включающий промежуточные комплексы. Укажите обратимые стадии процесса. Дайте объяснение тому, что удаление этанола из организма в целом подчиняется кинетике нулевого порядка.
11. Напишите возможные реакции для стадии окисления ацетальдегида до уксусной кислоты и для стадии преобразования ацетата в воду и углекислый газ.
12. Расскажите, что такое изоферменты, коферменты? Чем объясняется различие в скорости опьянения у представителей различных рас? у людей разного пола? Поясните, какое значение для процесса метаболизма этанола имеет отношение между окисленной и восстановленной формами никотин-амид-нуклеотида.
13. Объясните, почему противоядием при отравлениях метанолом или этиленгликолем является назначение больших количеств этанола.
3.4. Курсовая работа «особенности кинетики pgh-синтазной реакции»
3.4.1. Что такое pgh−синтазная реакция
При анализе механизмов многосубстратных реакций полезную информацию дает исследование зависимостей скоростей реакции от концентрации всех субстратов. Эти зависимости позволяют определить механизмы и получить определенную информацию о возможной последовательности стадий. Более подробно этот материал рассмотрен в [11, 13]. Обычно при изучении многосубстратных реакций поступают следующим образом. Проводят несколько опытов (серию), в каждом из которых изменяют концентрацию одного субстрата − того, влияние которого на скорость реакции изучают. При этом концентрации других субстратов поддерживают неизменными. Фиксируют полученную скорость реакции при этом. Очевидно, что ее изменение определяется концентрацией именно того субстрата, который рассматривается, т.к. концентрации остальных не изменялись. Такой прием позволяет исследовать кинетику сложных многосубстратных реакций, например, таких как PGH-синтазная реакция.
Вопросы строения фермента рассматриваемой ферментативной реакции, его биохимических особенностей не входят в круг рассматриваемых в курсовой работе, однако для лучшего понимания имеет смысл кратко остановиться на этой информации. Ферментом является простагландин-Н-синтаза, это фермент, близкий к пероксидазам, т.е. группе окислительно-восстановительных ферментов, использующих в качестве субстрата пероксид водорода. Пероксидазы хорошо представлены в растениях, бактериях, грибах, в клетках млекопитающих. Пероксидазы играют принципиальную роль в развитии неспецифического иммунного ответа, генерируя в макрофагах и нейтрофилах сильные реакционноспособные окислители уничтожающие чужеродные для организма агенты. Ферменты, способные использовать в качестве субстрата органические перекиси имеют большое значение в молекулярной физиологии животных и человека. К таким ферментам относится эндопероксидпростагландинсинтаза. Другие употребляемые названия этого фермента − простагландин-Н-синтаза (PGH- синтаза) или циклооксигеназа.
Учение о простагландинах, получившее бурное развитие в течение последних двух десятилетий, оказало существенное влияние на многие области биологии и медицины. Независимо друг от друга М. Goldblatt (1933, 1935) и U. von Euler (1934) обнаружили в предстательной железе человека и семенниках барана активность, стимулирующую сокращение гладких мышц и снижающую артериальное давление. Биологически активное вещество, оказавшееся кислым липидом, было названо простагландином, по месту первичного выделения вновь обнаруженного вещества. К настоящему времени из тканей животных и человека уже выделено около 100 различных первичных простагландинов и их метаболитов. Простагландины — класс кислых липидов, производных длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот, например арахидоновой. Жирные кислоты-предшественники либо поступают в организм с пищей и включаются как структурный элемент в фосфолипидный пул клеточных мембран, либо синтезируются in vivo из природных линолеиновой и лино-леновой жирных кислот. В основе структурной формулы простагландинов лежит гипотетическая молекула простаноевой кислоты, имеющая 20-членную углеродную цепь, часть которой заключена с циклопентановое кольцо. В естественных простагландинах к этому «скелету» присоединены гидроксильные и карбонильные группы в различных позициях.
Простагландины синтезируются практически во всех органах и тканях человека и животных, но не накапливаются в них, а образуются по мере необходимости под действием различных нейрогенных, физических, химических и других стимулов. В этом процессе участвует многокомпонентная система, условно называемая простагландин-синтетазой, которая катализирует превращение полиненасыщенных эссенциальных жирных кислот в эндоперекиси и последующую изомеризацию эндоперекисей в простагландины.
Активный центр фермента осуществляет очень сложную последовательность реакций превращения полиненасыщенной жирной арахидоновой кислоты в промежуточный простагландин H2:
Каталитический цикл осуществляется с участием как минимум четырех субстратов: арахидоновой кислоты, двух молекул кислорода и восстановителя − донора электронов. Химическое превращение включает присоединение молекулы кислорода, изомеризацию углеводородной цепи с образованием пятичленного цикла, образование гидроперекиси (PGG2) и восстановление гидроперекисной группировки до оксигруппы с образованием PGH2. Физиологически фермент чрезвычайно важен. Известно, что большая часть используемых в медицинской практике противовоспалительных препаратов, таких как аспирин, анальгин, индометацин, ибупрофен и др., представляют собой эффективные ингибиторы этого фермента. В [11] приводятся формально-кинетические схемы этого сложного ферментативного процесса, сведения о структурных изменениях, сопровождающих переход арахидоновой кислоты в простагландин H2, предложена молекулярная модель действия PGH-синтазы, приведены белковая структура и активный центр PGH-синтазы и указаны функциональные группы, входящие в активный центр. Структура активного центра PGH-синтазы приведена на рис.3.12.
Рис. 3.12 [14]
Как указано в [14] фермент простагландин H-синтаза (PGHS, К.Ф.1.14.99.1) осуществляет первый этап в биосинтезе всех простагландинов, а также тромбоксанов и простациклина, катализируя превращение молекулы арахидоновой кислоты в простагландин Н2. Простагландины - модуляторы сердечно-сосудистой, желудочно-кишечной и репродуктивной систем, являются медиаторами боли, воспаления, повышения температуры, аллергии, и поэтому фермент, катализирующий их биосинтез, представляет собой исключительно важную фармакологическую мишень. Терапевтический эффект аспирина и других нестероидных противовоспалительных средств обусловлен ингибированием PGHS.
PGHS является бифункциональным ферментом и катализирует 2 реакции - циклооксигеназное окисление арахидоновой кислоты двумя молекулами кислорода с образованием простагландина G2 и пероксидазное восстановление перекисной группы простагландина G2 в присутствии донора электронов с образованием простагландина H2. Обе реакции идут на одной молекуле белка на двух близко расположенных активных центрах. Обе реакции гемзависимы и сопровождаются необратимой инактивацией фермента в процессе реакции.
Анализ материала, приведенного в [11], показывает сложность изучаемой реакции, однако поскольку курсовая работа выполняется по физической химии, то нас будут интересовать вопросы чисто физико-химические: определение констант скоростей отдельных стадий, типа ингибирования, констант, характеризующих процессы ингибирования и т.д.
Задание на курсовую работу основано на использовании реальных экспериментальных данных, найденных в литературе [10,11] несколько подкорректированных для учебных целей. Данные, предлагаемые студенту для расчетов, получены в таких сериях опытов, в которых на скорость процесса влияет только концентрация того субстрата, который предлагается исследовать, остальные концентрации поддерживаются постоянными.
Одним из исследуемых субстратов будет выступать арахидоновая кислота (АА), другим − донор электронов адреналин (Ad). В некоторых вариантах предлагается рассмотреть гемин (Нm), который вообще говоря, представляет собой простетическую группу, осуществляющую окислительно-восстановительный катализ в активном центре PGH− синтазы и не является субстратом. Но, используемый в курсовой работе подход к вычислению различных констант в кинетическом уравнении и рассмотрению типов ингибирования, примененный к гемину, позволит решить определенные задачи и поэтому оправдан. В качестве ингибиторов данной реакции в разных вариантах будут рассмотрены анальгин, бруфен, бутадион, напроксен.