Глава 5 питательные среды и реактивы

1. Консерванты

Глицериновая смесь

Состав: Натрий хлорид (NaCl) (0,85%

раствор) — 1000 мл

Глицерин нейтральный — 500 мл

Натрий гидрофосфат безводный

(Na₂HPO₄) 20% раствор — 150 мл

Приготовление: смешивают первые два ингредиента и добавляют раствор натрия гидрофосфата в таком количестве, чтобы довести рН до 7,8—8,0, затем разливают в пробирки или флаконы по 10 мл, стерилизуют в автоклаве при 112 ⁰С в течение 15 мин или текучим паром 3 дня подряд. После стерилизации рН 7,6—7,8.

Фосфатно-буферная смесь

Состав: Калий дигидрофосфат (КН₂РО₄) — 0,45 г

Натрий гидрофосфат безводный(Na₂HPO₄) — 5,34 г

Вода дистиллированная — 1000 мл

Приготовление: ингредиенты смешивают, разливают по 10 мл в пробирки или флаконы, стерилизуют в автоклаве при 120 °С 30 мин.

Буферная глицерино-солевая смесь [Teague О., Clurmann A., 1916] в модификации Сакса [Sachs A., I934]

Состав: Натрий хлорид (NaCl) — 4,2 г

Калий гидрофосфат (К₂НРО₄) — 3,1 г

Калий дигидрофосфат

(КН₂РО₄) — 1 г

Глицерин нейтральный — 300 мл

Вода дистиллированная — 700 мл

Приготовление: ингредиенты растворяют, перемешивают, смесь разливают в стерильные пробирки по 5 мл и автоклавируют при 112°С 30 мин. Рекомендуется с целью лучшего прocмотpa раствор слабо подкрашивать феноловым красным.

Изотонический раствор натрия хлорида

Состав: Натрий хлорид (NaCl) — 8,5 г

Вода дистиллированная — 1000 мл

Приготовление: соль растворяют при подогревании, фильтруют, устанавливают рН 7,0—7,2, разливают в пробирки по 5—7 мл, стерилизуют при 121 °С 30 мин.

Среды обогащения

Селенитовая среда [Leifson E., 1936], модификация

Среда предназначена для накопления в материале сальмонелл.

Принцип действия: пептон является питательной основой, натрий гидроселенит — ингибитором сопутствующей микрофлоры; фосфаты обеспечивают буферные свойства, а лактоза служит компонентом, влияющим на реакцию среды.

Состав: Натрий гидроселенит (NaHSeO₃)

без примеси теллура — 4 г

Пептон (желательно венгерский «Рихтер» или чехословацкий

«Спофа») — 5 г

Натрий гидрофосфат безводный

(Na₂HPO₄) — 7 г

Натрий дигидрофосфат безводный

(NaH₂PО₄) — 3 г

Лактоза — 4 г

Вода дистиллированная — 1000 мл

Приготовление: среду готовят из двух растворов.

I раствор. Предварительно определяют количественные соотношения фосфатов при данном образце пептона (гидроселенита натрия) с тем, чтобы готовая среда имела рН 6,9—7,1. Такая подтитровка нужна всегда при изменении серии любого из входящих в среду основных ингредиентов.

После установления количественных соотношений фосфатов к раствору добавляют пептон и лактозу. Разливают во флаконы по 50 мл и стерилизуют текучим паром два дня по 30 мин или такой же срок при 112°С. Количество фосфатов в рецепте среды дано в расчете на безводные препараты. При отсутствии таковых заранее заготовленные навески «выветривают» в термостате в течение 15—16 сут.

II раствор. 10% раствор натрия гидроселенита готовят на стерильной дистиллированной воде ex tempore.

Перед началом работы в каждый флакон с 50 мл основного (I) раствора добавляют 2 мл раствора натрия гидроселенита (раствора II), асептически разливают по 5—7 мл в стерильные пробирки и закрывают плотно пробками. Дальнейшая стерилизация не требуется. Основной (I) раствор среды можно хранить в холодильнике 1—2 мес. Для приготовления среды следует использовать высококачественный пептон.

Магниевая среда. [Rappaport E., Konforti N., Navon В., 1956]. Модифицирована В. Л. Шигановой и Г. П. Калиной в 1972 г. (среда М)

Среда предназначена для накопления сальмонелл и содержит три раствора.

Принцип действия: ингибирующий эффект среды для сопутствующей микрофлоры основан на влиянии бриллиантового зеленого и дегидратирующем действии магния хлорида, при этом на рост сальмонелл указанные вещества в данных количествах не влияют; пептон с дрожжевым диализатом создают достаточную питательную основу для активного размножения сальмонелл, а КН₂РО₄ — буферность среды.

Состав: Раствор I

Пептон — 4,2 г

Натрий хлорид (NaCl) — 7,15 г

Калий дигидрофосфат

(КН₂РО₄) — 1,43 г

Дрожжевой диализат — 9 мл

Вода дистиллированная — 890 мл

Раствор II

Магний хлорид (МgСl₂6Н₂О) — 35,7 г

Вода дистиллированная — 90 мл

Раствор III

Бриллиантовый зеленый 0,5%

водный раствор — 0,9 мл

Приготовление: все три раствора смешивают, разливают определенные объемы в колбы, флаконы или пробирки, стерилизуют при 112 ⁰С 30 мин.

Среда Мюллера [Muller L., 1923]

Тетратионатовый бульон Мюллера является средой накопления для сальмонелл.

Принцип действия: в среде при добавлении к ней тиосульфата натрия и раствора Люголя ex tempore образуется тетратионат натрия (Na₂S₄O₆). Реакция его образования протекает по уравнению: 21 + 2Na₂S₂О₃ = Nа₂S₄О₆ + 2NаI. Это вещество, не влияя на развитие большинства сальмонелл, является ингибитором для эшерихий и другой микрофлоры кишечника. В среде бульон обеспечивает питательные вещества, мел обладает буферными свойствами.

Состав: Мел, стерилизованный сухим жаром, или — 45 г

Кальций карбонат (СаСО₃),

сухой, стерильный — 25 г

Бульон Хоттингера, содержащий 1,2—1,3%

аминного азоnа — 900 мл

Раствор Люголя — 20 мл

Натрий тиосульфат (Na₂S₂O₃•5Н₂О)

50% стерильный раствор — 100 мл

Приготовление: в стерильные флаконы помещают по 4,5 г мела, стерилизуют сухим жаром, после чего в каждый флакон наливают по 90 мл бульона Хоттингера. Стерилизуют при 121 °С 30 мин. рН 7,2—7,4. Затем ex tempore асептически добавляют в каждый флакон точно по 2 мл раствора Люголя [калий йодид (KI) 20 г, йод кристаллический 25 г, вода дистиллированная 100 мл] и по 10 мл раствора натрия тиосульфата (натрий тиосульфат 50 г, вода дистиллированная 100 мл), хорошо смешивают и разливают по пробиркам. Готовая среда стерилизации не подлежит.

Приготовление: в измерительный цилиндр насыпают натрий тиосульфат и добавляют воду по 100 мл, растворяют, переливают во флакон, стерилизуют текучим паром 30 миy.

Среда Кауфмана [Kauffmann F., 1935]

Состав: Среда Мюллера (стерильная) — 500 мл

Желчь бычья (стерильная) — 250 мл

Бриллиантовый зеленый (0,1%

водный раствор) — 50 мл

Приготовление: ингредиенты смешивают, асептически разливают в стерильные пробирки по 10 мл. Не стерилизуют.

Желчный бульон

Состав: бульон мясопептонный Хоттингера — 800 мл

Желчь бычья нативпая — 200 мл

Приготовление: рН должен быть равен 7,6. Разливают в стерильные пробирки или флаконы. Стерилизуют текучим паром 2 дня по 30 мин.

Среда Рапопорт [Рапопорт М. и Вайнтрауб Л., 1935]

Состав: бульон мясопептонный

или Хоттингера — 900 мл

Желчь бычья — 100 мл

Глюкоза — 20 г

Индикатор Андреде — мл

Приготовление: ингредиенты смешивают, разливают во флаконы с поплавками по 50 мл. Стерилизуют текучим паром три дня по 30 мин.

Среда обогащения ЕЕ [Mossel D. et al., 1963], в модификации Г. П. Калины (1981)

Среда ЕЕ предназначена для накопления сальмонелл и эдвардсиелл.

Принцип действия: желчные соли и относительно токсичный краситель подавляют развитие сопутствующей микрофлоры.

Состав:Пептон — 10 г

Глюкоза — 5 г

Натрий гидрофосфат

(Na₂HPО₄H₂0) — 8 г

Калий дигидрофосфат (КН₂РО₄) — 2 г

Желчь бычья — 20 мл

или

Желчные соли (по Олькеницкому) — 3 г

Бриллиантовый зеленый 0,5%

водный раствор — 3 мл

Вода дистиллированная — 1000 мл

Приготовление: все ингредиенты, кроме красителя, растворяют в воде, стерилизуют при 112°С 15 мин. Затем добавляют бриллиантовый зеленый и разливают в стерильные пробирки по 10 мл.

Приготовление желчных солей по И. С. Олькеницкому (1957)

К 1000 мл желчи (бычьей или свиной) добавляют 40 г гидроокиси натрия (NaOH), перемешивают и помещают в автоклав. Гидролиз проводят при 1,5 атм в течение 3 ч (можно дважды по 2 ч). К гидролизату для осаждения жирных кислот прибавляют 100 мл 20% раствора бария хлорида (ВаСl₂2H₂O) и прогревают в автоклаве 1 ч. На следующий день гидролизаn сливают с осадка и фильтруют. Затем при постоянном помешивании добавляют 20% раствор соляной кислоты (до кислой реакции) и оставляют на 18—20 ч. После этого сливают, промывают водой и прибавляют, нагревая 40% раствор гидроокиси натрия (до щелочной реакции). Полученные натриевые соля желчных кислот выливают на противень и высушивают до порошкообразного состояния в сушильном шкафу при 115 ⁰С.

Среда Эт-1 (Калина Г. П., 1981)

Среда Эт-1 описана как среда обогащения для эдвардсиелл. Принцип действия: основан на относительной устойчивости эдвардсиелл к полимиксину.

Состав: Бульон слабощелочной

(стерильный) — 1000 мл

Глюкоза — 2 г

Розоловая кислота 5%

спиртовой раствор) — 2 мл

Полимиксин — 25 000 ЕД

Приготовление: глюкозу и розоловую кислоту растворяют в бульоне при подогревании, затем кипятят в водяной бане 15—20 мин, добавляют полимиксин и разливают асептически в стерильные пробирки или колбы.

Среда обогащения для протеев — П-1 [Калина Г. П., 1975]

Среда П-1 предназначена для преимущественного обнаружения протеев в патологическом материале и объектах окружающей среды.

Принцип действия: протеи устойчивы к полимиксину, желчным солям и токсичным красителям, подавляющим рост сопутствующей микрофлоры. Мючевина использована в качестве дополнительного источника азота.

Состав: Бульон питательный сухой — 15 г

Вода дистиллированная — 1000 мл

или

Бульон Хоттингера, стерильный — 1000 мл

Маннит — 1 г

Желчные соли (по Ольксницкому) — 5 г

Калий дигидрофосфат (КН₂РО₄) — 0,8 г

Кристаллический фиолетовый

(0,01% водный раствор) — 20 мл

или

Бриллиантовый зеленый

(0,1%водный раствор) — 5 мл

Мочевина (50% раствор) — 10 мл

Полимиксин — 1 000 000 ЕД

Приготовление: все ингредиенты, кроме мочевины и антибиотика, растворить, хорошо перемешать, профильтровать и стерилизовать кипячением в водяной бане (15 мин). Затем добавить полимиксин, мочевину, тщательно смешать и асептически разлить в стерильные пробирки по 5—6 мл.

Среда обогащения для клебсиелл — К-1 [Калина Г. П.1980]

Среда К-1 узконаправленного действия для обнаружения клебсиелл в патологическом материале или объектах окружающей среды.

Принцип действия: в среду ограниченного минерального состава введены рафиноза (в качестве единственного источника углерода) и мочевина (как единственный источник азота). Указанные вещества не усваиваются многими грамотрицателытыми бактериями или усваиваются лишь в присутствии дополнительных питательных ингредиентов, что делает среду высокоэлективной для клебсиелл. Развитие грамположительной микрофлоры иигибируется введением в среду кристаллического фиолетового.

Состав: Натрий хлорид (NaCl) — 5 г

Магний сульфат (MgSO₄7H₂O) — 0,2 г

Калий дигидрофосфат (КН₂РО₄) — 2 г

Калий гидрофосфат (К₂НРО₄) — 2 г

Раффиноза — 2 г

Бромтимоловый синий (1,6%

щелочной раствор) — 2 мл

Кристаллический фиолетовый

(0,01% водный раствор) — 20 мл

Мочевина (50% раствор) — 4 мл

Вода деионизированная или

дистиллированная — 1000 мл

Приготовление: после растворения ингредиентов (кроме мочевины) и кипячения их в водяной бане 15 мин добавляют раствор мочевины и асептично разливают по 4—5 мл в стерильные пробирки.

Буферная среда обогащения для иерсиний [Ющенко Г. В., Дунаев В. И., 1980]

Среда служит при выделении иерсиний для подращивания материала перед высевом на пластинчатые дифференциальные среды.

Состав Натрий хлорид (NaCl) — 8,5 г

Натрий гидрофосфат

(Na₂HPО₄12H₂0) 1/15 М-раствор — 3 мл

Калий дигидрофосфат (КН₂РО₄) 1/15 М-раствор — 7 мл

Вода дистиллированная — 990 мл

Приготовление: предварительно готовят по 100 мл 1/15 М-растворов указанных солей. Затем к изотоническому раствору натрия хлорида добавляют указанное количество приготовленных растворов, смешивают, фильтруют, разливают в пробирки по 5—6 мл и стерилизуют при 116 ⁰С 10 мин или 30 мин текучим паром рН среды 7,2.