Тесты идентификации микроорганизмов

Определение индола. Полоски фильтровальной бумаги пропитывают реактивом, представляющим собой смесь парадиметиламидобензальдегида - 5 г, спирта этилового 96-градусного - 50 мл, фосфорной кислоты очищенной концентрированной - 10 мл. После растворения порошка полученной тепловатой жидкостью смачивают полоски фильтровальной бумаги, высушивают и хранят их в банке темного стекла. Цвет бумажек желтый. Посев культуры производят на среду с 0,3-процентным полужидким агаром, который одновременно служит для определения подвижности культуры. Для определения индола берут приготовленные бумажки и помещают в пробирки под пробку. Посевы ставят в термостат при температуре 37° на 18 - 24 часа. О наличии индола судят по изменению цвета бумажек от серовато-розового до интенсивно-малинового.

Определение сероводорода проводят при посеве на среду Олькеницкого. Положительный результат определяется по почернению среды.

Определение подвижности бактерий проводят при посеве уколом в столбик 0,3-процентного агара в пробирке, содержащей 5 мл среды. Подвижные микробы растут в толще среды по ходу укола.

Ферментация глюкозы и маннита в анаэробных условиях. Среду Гисса с глюкозой или маннитом и индикатором ВР разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют 20 минут при 0,5 атм. Перед посевом среду "регенерируют". Посев производят в две пробирки уколом. Одну пробирку заливают стерильным вазелиновым маслом - 1,0 мл. Помещают в термостат при температуре 37°. Наблюдение ведут до 5 суток. Стафилококки образуют кислоту из глюкозы в обеих пробирках. Микрококки образуют кислоту только в аэробных условиях. Все виды стафилококков ферментируют маннит аэробно, в анаэробных условиях ферментирует маннит только золотистый стафилококк. При ферментации нижняя часть столбика окрашена в синий цвет, при окислении верхняя часть столбика синеет.

Реакция плазмокоагуляции является одним из основных тестов определения патогенности стафилококков. Для реакции может быть использована сухая или жидкая кроличья плазма, жидкая человеческая плазма. Сухая кроличья плазма выпускается предприятием по производству бактерийных препаратов Белорусского НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ БССР. Жидкую плазму получают при взятии крови в пробирку с 1,0 мл 5-процентного раствора лимоннокислого натрия. Для перемешивания крови пробирку вращают между ладонями (не образовывать пены!), затем центрифугируют и отсасывают плазму пастеровской пипеткой в стерильную пробирку. Приготовленную плазму хранят на холоде. Для опыта плазму разводят стерильным физиологическим раствором в 2 или 4 раза. Разведенную плазму разливают по 0,5 мл в стерильные пробирки с пробками и вносят одну петлю испытуемой культуры. Культуру растирают до образования равномерной мути. Пробирки ставят в термостат на 3 - 6 часов, просматривая через каждый час, и оставляют при комнатной температуре до утра, отмечая результаты реакции. К каждой постановке опыта ставят для контроля пробирки, в одной из которых - плазма и физиологический раствор, в другой - плазма и заведомо плазмокоагулирующая культура стафилококка. При положительном результате плазма уплотняется и появляется сгусток. Если была использована цельная плазма, сгусток уплотняется полностью (++++). Результаты учитываются следующим образом: плазма с физиологическим раствором дает отрицательный результат; плазма с плазмокоагулирующим стафилококком ++++; плазма с испытуемой культурой может давать положительный результат, оцениваемый (++), (+++), (++++), или отрицательный. Культуры стафилококка, коагулирующие плазму в течение 2 - 4 часов, обладают большей патогенностью, чем коагулирующие плазму в более поздние сроки или на следующий день.

Оксидазная проба. Для оксидазной пробы на стерильную фильтровальную бумагу (5 см в диаметре), помещенную в чашку Петри, наносят 1 каплю 0,5 - 1-процентного раствора ди- или тетраметилпарафенилендиамина. Затем петлей наносят 18-часовую испытуемую агаровую культуру. Реакцию учитывают через 20 - 30 секунд. При наличии оксидазы колонии окрашиваются в розовый или темно-красный цвет. Можно использовать бумажные диски, заранее пропитанные данным реактивом.

Определение уреазной активности проводится одним из двух методов. Первый - на среде с мочевиной (по Преусу). В среду засевают культуру, учет результатов проводят через 18 часов. Культуры, обладающие ферментом уреазой, утилизируют мочевину и изменяют цвет среды.

Согласно второму методу суточную культуру микроорганизмов с МПА петлей помещают в 0,5-процентный раствор мочевины, разлитый в агглютинационную пластину. Затем проводят инкубацию в термостате при температуре 37° в течение 1,5 часа. Образование аммония проверяется реактивом Несслера. При положительной реакции образуется желтая "пуговка" на дне лунки.

Определение ДНК-азной активности. В чашку Петри с 2-процентным МПА, содержащим ДНК из расчета 1 мг на 1 мл среды (10 мг на 10 мл среды в каждой чашке), засевают на сектора полоской 10 - 12 культур стафилококка. Чашки помещают в термостат на 18 часов, затем каждую чашку заливают 5 мл 1 N соляной кислоты. Вокруг колоний стафилококков, выделяющих ДНК-азу, образуются прозрачные зоны.

Определение протеина A стафилококков методом иммунофлюоресценции. Для

постановки реакции необходимы: чистая культура стафилококков в концентрации

9

10 кл/мл в 0,15 М растворе NaCl, нормальная сыворотка барана,

инактивированная при 56° в течение 30 минут, люминесцирующие антитела к

гамма-глобулинам барана в рабочем разведении.

На обезжиренное предметное стекло с помощью пастеровской пипетки наносят каплю суспензии стафилококков. Мазок подсушивают на воздухе, затем фиксируют в 96-градусном этиловом спирте в течение 15 - 20 минут и снова подсушивают. На фиксированный мазок наносят одну каплю инактивированной прогретой при 60° в течение 30 минут нормальной сыворотки барана в разведении 1:8 - 1:16. Время инкубации в термостате при температуре 37° - 15 - 20 минут. Мазок промывают и трех сменах 0,15 М NaCl с pH 7,0 - 7,2, затем высушивают на воздухе. На высушенный мазок наносят одну каплю люминесцирующих антител к гамма-глобулинам барана в рабочем разведении. Инкубация проводится в течение 15 - 20 минут при температуре 37°. Затем мазок отмывают от люминесцирующего глобулина и промывают последовательно в трех-четырех сменах физиологического раствора с pH 7,2 - 7,4. После последнего промывания мазок подсушивают. Просматривают препараты под люминесцентным микроскопом с иммерсионным объективом х90. О наличии протеина A на клеточной стенке стафилококков судят по свечению клеток микроорганизмов. Оценка свечения: ++++ - четкое, очень яркое свечение ободка при темной середине клетки; +++ - четкое, яркое свечение ободка при темной середине; ++ - заметное окрашивание всей клетки; + - видны контуры клетки. О наличии протеина A судят по реакции, оцениваемой в +++ и ++++.

Определение чувствительности стафилококков к новобиоцину. Стафилококки по чувствительности к новобиоцину дифференцируют на Staphylococcus aureus, epidermidis и saprophyticus. Минимальная подавляющая концентрация для Staphylococcus aureus и epidermidis составляет 2 мкг. При данной концентрации новобиоцина и больше 2 мкг растут S. aureus и S. epidermidis. При концентрации новобиоцина меньше 2 мкг растут S. saprophyticus.

Для определения чувствительности стафилококков готовят новобиоцин в следующих разведениях: 1) 12 мг новобиоцина + 10 мл дистиллированной воды - исходное разведение; 2) 1 мл исходного разведения + 10 мл дистиллированной воды (100 мкг новобиоцина в 1 мл); 3) 1 мл второго разведения + 4 мл дистиллированной воды (20 мкг новобиоцина в 1 мл).

Для посева берут 9 мл расплавленного агара (МПА, Хоттингера), добавляют по 1 мл третьего разведения, разливают в чашки. Дают агару застыть. Посев производят петлей штрихом. Инкубируют в термостате при температуре 37° 18 - 24 часа, после чего учитывают результаты.

Проба с желчью служит для дифференциации пневмококков и зеленящих стрептококков. Стерильные диски из фильтровальной бумаги (можно использовать чистые диски, предназначенные для пропитывания антибиотиками) с соблюдением правил асептики пропитывают стерильным раствором 10-процентной желчи и подсушивают в закрытых чашках Петри. Диски с желчью накладывают на посеянный газон исследуемого материала, выросшего на 5-процентном кровяном агаре. Через 18 часов роста в термостате при температуре 37° производят учет результатов. Пневмококки образуют зону лизиса вокруг диска с желчью.

Определение потребностей в X- и V-факторах крови. Чашки Петри с простым агаром и агаром с кровью засевают: одну половину исследуемой культурой, а другую - исследуемой культурой с культурой Staphylococcus aureus. Если наблюдается рост на агаре с кровью, то исследуемый микроб требует X-фактор. Если наблюдается на кровяном агаре рост испытуемой культуры совместно со стафилококком, то исследуемый микроб требует X- и V-факторы. Если наблюдается рост вместе со стафилококком на простом агаре, то микробы требуют V-фактор. Если наблюдается рост на простом агаре на секторе без стафилококка, то исследуемая культура не требует ни X-, ни V-факторов.

При наличии дисков с X- и V-факторами на засеянную поверхность питательного агара накладывают диски на расстоянии 2 см друг от друга. Определяют рост вблизи одного из них. Для такого метода определения необходимо приготовить диски с X- и V-факторами.

При приготовлении дисков с X-факторами центрифугируют 40 мл крови, к

осадку эритроцитов добавляют при встряхивании 100 мл ацетона, содержащего

1,2 мл концентрированной HCl, фильтруют, затем к фильтрату добавляют 100 -

120 мл воды для осаждения гемина. Собирают фильтрат и промывают его водой.

Растворяют гемин в 25 мл 0,1 М Na HPO и стерилизуют при 115° 10 минут.

2 4

Диски с V-факторами готовят следующим образом: суспензируют 50 г

прессованных хлебных дрожжей в 100 мл 0,2 М KH PO , нагревают в водяной

2 4

бане при 80° 20 минут. Осветляют центрифугированием и стерилизуют

надосадочную жидкость фильтрацией. Хранят в рефрижераторе.

Фильтровальную бумагу (ватман N 3) разрезают на диски диаметром около 1 см. Диски смачивают растворами X- и V-факторов и их смесью.

Определение щелочной фосфатазы. К 100 мл расплавленного и охлажденного 2-процентного МПА добавляют паранитрофенилфосфат (двунатриевая соль) из расчета конечной концентрации 0,05% и среду разливают в чашки Петри. Посев исследуемых штаммов (агаровые культуры) осуществляют петлей или штампом-репликатором. Учет результатов производят через 18 часов роста при 37° по появлению желтого окрашивания вокруг колоний стафилококка.