Культуральная характеристика corynebacterium

------------------------+----------+--------------+------------------------

¦ Тесты ¦C. xerosis¦C. diphtheriae¦C. pseudodiphtheriticum¦

+-----------------------+----------+--------------+-----------------------+

¦Бактериоскопия ¦Имеет ¦Характерная ¦Не имеет зерен волютина¦

¦ ¦гранулы ¦морфология ¦ ¦

¦ ¦волютина ¦клеток с зер- ¦ ¦

¦ ¦ ¦нами волютина ¦ ¦

¦Гемолиз ¦- ¦+ ¦- ¦

¦Сахароза ¦+ ¦- ¦- ¦

¦Уреаза ¦- ¦- ¦+ ¦

¦Желатина ¦- ¦- ¦- ¦

------------------------+----------+--------------+------------------------

Рецепты питательных сред

Кровяной агар. Расплавляют определенное количество 2-процентного мясопептонного стерильного агара, охлаждают его до температуры 45 °С (не выше!) и прибавляют 5 - 10 мл дефибринированной стерильно взятой крови лошади, кролика, барана или человека. Добавление крови производят, соблюдая правила стерильности. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри, предварительно нагретые в термостате, дают ей застыть и подсушивают в термостате. Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет.

Желточно-солевой агар. Для приготовления желточно-солевого агара готовят впрок мясопептонный агар (pH 7,2 - 7,4) с содержанием 10% хлорида натрия. После разлива во флаконы по 100 - 200 мл агара стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин. при 1 атм. Перед употреблением растапливают, охлаждают до 45 - 50° и добавляют 20% (по объему) стерильной желточной взвеси: один желток куриного яйца на 150 - 200 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Среду быстро перемешивают и разливают в стерильные чашки, которые продолжительное время могут сохраняться в холодильнике.

Желчный бульон. К мясопептонному бульону, приготовленному на переваре Хоттингера, добавляют нативную желчь, устанавливают pH 7,6. При добавлении к 900 мл бульона 100 мл желчи получается 10-процентный желчный бульон. При добавлении к 800 мл бульона 200 мл желчи получается 20-процентный желчный бульон. Приготовленный бульон стерилизуют в автоклаве 20 - 30 минут при 1 атм.

Кровяной агар Левинталя. К растопленному 2-процентному агару, приготовленному на мясном бульоне и охлажденному до 70°, добавляют 10% дефибринированной крови, тщательно перемешивают и ставят на огонь через асбестовую сетку, все время встряхивая. При образовании пены агар снимают с огня. Повторяют такое кипячение три раза, после чего смеси дают немного отстояться для осаждения сгустков. Стерильно разливают отдельно прозрачную часть - во флаконы (для чашек), нижнюю часть (с осадком) - в пробирки. Контроль стерильности питательных сред проводят в термостате при 37° в течение 24 - 48 часов.

Цитратный агар Симмонса. В 1 л дистиллированной воды растворяют 0,2 г сульфата магния, 1,5 г фосфата натрия-аммония, 1 г одноосновного фосфата калия, 3 г цитрата натрия кристаллического. Смесь стерилизуют в автоклаве, прибавляют 20 г агар-агара, нагревают до его расплавления, устанавливают pH 7,2 и затем прибавляют 1 мл 1,5-процентного спиртового раствора бромтимолового синего.

Цитратная среда Христенсена включает в себя лимоннокислый натрий - 3 г, глюкозу - 0,2 г, дрожжевой экстракт - 22 мл, цистин солянокислый - 0,1 г, фосфорнокислый калий однозамещенный - 1 г, хлористый натрий - 5 г, феноловый красный 0,4-процентный водный раствор - 3 мл, агар-агар - 15 г, дистиллированную воду - 1000 мл. Среду стерилизуют в течение 15 мин. при 1 атм., pH среды не устанавливается.

Для приготовления среды все соли предварительно растворяют в малых количествах воды. Затем соединяют с агаром и оставляют до его набухания. Состав кипятят до полного растворения агара, фильтруют и добавляют 0,4-процентный водный раствор фенолового красного (3 мл на 1 л среды). При образовании щелочи среда краснеет.

Приготовление дрожжевого экстракта для среды Христенсена производят следующим образом. В 1 л воды растворяют 500 г хлебных дрожжей, кипятят в течение 1 часа, после чего фильтруют через бумажный фильтр, стерилизуют в течение 30 минут при 0,5 атм. Добавляют 22 мл экстракта на 1 л среды Христенсена.

Сахарный бульон (бульон с глюкозой). К 100 мл мясопептонного бульона нейтральной реакции прибавляют 0,5 - 1 г глюкозы. Перед добавлением к бульону глюкозу растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Приготовленную среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут или однократно в автоклаве при 0,5 атм. 30 минут.

Среда с желатиной. К мясопептонному бульону прибавляют мелко нарезанную желатину из расчета 10 - 15 г на 100 мл. Желатине дают набухнуть, затем ее растворяют при медленном нагревании в водяной бане, доведенной до температуры 40 - 45 °С. Устанавливают pH 7,0, прибавляя к расплавленной желатине 10-процентный раствор бикарбоната натрия.

Профильтрованную среду разливают в пробирки по 5 - 8 мл так, чтобы не намочить край и верхнюю часть пробирки, соприкасающуюся с пробкой. Стерилизацию среды производят дробно 3 дня подряд по 1 часу при температуре 100 °С или однократно при 0,5 атм. в течение 20 минут. После стерилизации среду охлаждают в строго вертикальном положении, чтобы верхняя часть столбика при застудневании оставалась совершенно ровной.

Бульон с хлористым натрием. К 100 мл мясопептонного бульона нейтральной реакции прибавляют 6,5 г хлористого натрия. Приготовленную среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут или однократно в автоклаве при 0,5 атм. 30 минут.

Ацетатная среда. В 1 л дистиллированной воды растворяют 0,2 г сульфата магния, 1,5 г фосфата натрия-аммония, 1 г одноосновного фосфата калия, 3 г ацетата натрия. Смесь стерилизуют в автоклаве. Прибавляют 20 г агар-агара и нагревают до его расплавления, устанавливают pH 7,2 и затем прибавляют 1 мл 1,5-процентного спиртового раствора бромтимолового синего. Среда имеет травянисто-зеленый цвет.

Среда Тароцци. Нежирное мясо или печень нарезают мелкими кусочками, взвешивают и заливают тройным количеством (по весу) питательного бульона. После кипячения в течение 30 минут среду фильтруют. Кусочки мяса отмывают на сите водопроводной водой, просушивают, раскладывают по 2 - 3 кусочка в пробирки и по 8 - 10 кусочков в колбочки. Затем заливают их бульоном - по 5 - 6 мл в пробирки и по 100 мл в колбочки и стерилизуют при 1 атм. 30 минут.

Модифицированная среда Олькеницкого включает в себя сухой питательный агар (можно агар "Д") - 3 г, сухую среду Гисса с лактозой и индикатором ВР - 40 г, глюкозу х.ч. - 1 г, мочевину х.ч. - 10 г, гипосульфат натрия - 0,3 г, соль Мора - 0,2 г, воду дистиллированную - до 1000 мл.

Предварительно в пробирке с небольшим количеством дистиллированной воды растворяют соль Мора с гипосульфитом. Мочевину с глюкозой растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды в колбе на водяной бане. Оба раствора смешивают, добавляют сухой агар и среду Гисса с лактозой и доливают дистиллированную воду. Устанавливают pH 7,2 - 7,4, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют при 0,5 атм. 20 минут, после стерилизации устанавливают пробирки так, чтобы после застывания агара в пробирках образовался столбик и косяк.

На этой среде изучают свойства микроорганизмов с помощью следующих тестов:

- разложение глюкозы с образованием кислоты и газа определяют по посинению столбика с пузырьками газа в толще столбика;

- разложение лактозы - по посинению скошенной верхней части агара;

- образование фермента уреазы - по изменению цвета среды в оранжевый;

- способность к образованию сероводорода - по почернению среды (от темной линии по месту ее прокола до почернения всего столбика).

Среды с углеводами (Гисса). Среды приготавливают из расчета 2 г сухого агара с индикатором ВР и глюкозой, лактозой, маннитом, сахарозой, мальтозой на 100 мл холодной дистиллированной воды, тщательно перемешивают, кипятят на слабом огне до полного расплавления агара, после чего фильтруют через ватный фильтр, устанавливают pH 7,0 - 7,4. Горячую среду разливают в пробирки и стерилизуют текучим паром три дня подряд по 30 минут в день или при 0,5 атм. 20 минут.

Молоко с метиленовым синим. Свежее молоко доводят до кипения, оставляют в прохладном месте на сутки, освобождают от сливок, вторично кипятят, оставляют снова на сутки и вторично снимают верхний слой. Обезжиренное таким образом молоко фильтруют через толстый слой ваты, подщелачивают 10-процентным раствором карбоната натрия до pH 7,2. К 100 мл молока добавляют 2 мл 1-процентного водного раствора метиленового синего. Приготовленную среду разливают по 5 мл в стерильные пробирки и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут. Среда после остывания имеет насыщенно голубой цвет, при редукции метиленового синего среда обесцвечивается и приобретает кремовый цвет.

Среда с малонатом натрия. В 1 л воды растворяют 2 г сернокислого

аммония - (NH ) SO , 0,4 г однозамещенного фосфорнокислого калия (KH PO ),

4 2 4 2 4

0,6 г двузамещенного фосфорнокислого калия (K HPO ), 2 г NaCl, 3 г малоната

2 4

натрия, 0,25 глюкозы х.ч., 30 мл дрожжевого экстракта и 12 мл

0,2-процентного раствора бромтимол синего водного. Растворяют при

подогревании плотные части, фильтруют через бумажный фильтр и добавляют

индикатор. Разливают в серологические пробирки по 2 мл, стерилизуют при 0,5

атм. 30 минут.

Фенилаланиновый агар. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 0,1 г L-

или 0,2 DL-фенилаланина, предварительно растворенного в 1 мл

дистиллированной воды, 0,1 г двузамещенного фосфорнокислого натрия, 0,5 г

хлористого натрия, 0,3 г дрожжевого экстракта, 1,2 г агар-агара. Смесь

подогревают в воде, фильтруют, разливают в серологические пробирки по 2 мл,

стерилизуют при 0,5 атм. 30 минут и сразу после стерилизации скашивают

длинным косяком (среда не должна повторно подогреваться!).

Отдельно готовят 10-процентный раствор FeCl , который является

3

индикатором реакции (не стерилизуют). Несколько капель индикатора добавляют

на поверхность роста культуры. При дезаминировании фенилаланина образуется

фенилперувинная кислота, в результате чего на конденсате и косяке

появляется зеленое окрашивание.

Среда Кларка. Смешивают в ступке 0,5 г пептона, 0,5 г глюкозы, 0,5 г

K HPO и растворяют в 80 мл дистиллированной воды, подогревая и помешивая

2 4

на водяной бане в течение 20 минут. Фильтруют через бумажный фильтр,

охлаждают до 20° и доливают дистиллированной водой до 100 мл. Разливают в

пробирки по 5 мл и стерилизуют дробно три дня подряд при 100 °С.

Среда Кларка служит для определения интенсивности кислотообразования из глюкозы с помощью реакций с метил-рот и Фогес-Проскауера. Приводим эти реакции.

1. Реакция с метил-рот. Культуру засевают на среду Кларка. К 5 мл четырехсуточной культуры прибавляют 5 капель 0,04-процентного раствора метилового красного (1 мл 1,6-процентного спиртового раствора метил-рота и 39 мл 96-градусного спирта, раствор сохраняется неограниченное время). При сильном кислотообразовании (pH < 5) появляется красное окрашивание, при слабом (pH > 5) - желтое. При красном окрашивании реакции обозначают MR+, при желтом окрашивании MR-.

2. Реакция Фогес-Проскауера (образование ацетилметилкарбинола из глюкозы). Культуру засевают на среду Кларка и выращивают в течение 4 - 5 дней при температуре 30°. К 5 мл культуры прибавляют 1 мл 10-процентного водного раствора едкого калия и ставят в термостат при температуре 37°. Окраска появляется постепенно, поэтому реакция оценивается через 18 - 24 часа. Розовая окраска с желтой флюоресценцией, характерная для спиртовых растворов эозина, означает положительный результат. Если цвет не изменяется и среда остается бесцветной, результат отрицательный. Обычно эта реакция получается у бактерий, которые сбраживают глюкозу и дают отрицательную реакцию с метиловым красным (pH < 5).

Среды с аминокислотами (лизином, аргинином, орнитином) приготовляются следующим образом. К 120 мл бульона добавляют 180 мл дистиллированной воды, 1,5 пептона, 0,3 глюкозы (pH 6 - 6,1). Смесь кипятят, фильтруют и смешивают с 1,6 мл 0,2-процентного бромтимола синего. Полученную смесь делят на две части, к одной из них добавляют 1,5 г лизина, аргинина или орнитина. Вторая часть остается в качестве контроля. Среда должна иметь цвет зеленой травы. Стерилизацию проводят в течение 30 минут при 0,5 атм.

Комбинированная среда для посева крови. Во флаконы емкостью 100 мл разливают по 30 - 40 мл 2,0-процентного агара Хоттингера или сахарного агара. Стерилизуют 30 минут при 0,5 атм., затем агар скашивают. Стерильно добавляют 0,5 - 1-процентный сахарный бульон, чтобы он не покрывал всю поверхность агара.

Среда с мочевиной (по Преусу) имеет следующий состав: мартеновский бульон (pH 7,0) - 100 мл, глюкоза - 5 г, 50-процентный раствор мочевины - 20 мл, 0,2-процентный раствор бромтимола синего - 12 мл. Среда может быть приготовлена жидкой или плотной. Для получения плотной среды добавляют 17 г агар-агара. Среду разливают в стерильные бактериологические пробирки по 5 мл и стерилизуют текучим паром 15 минут или при 0,3 атм. 20 минут. Среда имеет светло-зеленый цвет.

Среда для пневмококка и палочки инфлюэнцы. К агару Хоттингера (аминный азот 170 мг%, pH 7,6) добавляют 2,5% свежей дефибринированной кроличьей крови и разливают в чашки Петри по 20 мл.