Розділ 2. Водопідготовка

2.1 Відомості про пірогенність води для ін'єкцій

При парентеральному, особливо при внутрішньосудинному введенні препаратів, іноді спостерігається швидке підвищення температури тіла до 40 °С, що супроводжується почастішанням пульсу, ознобом, потовиділенням, нудотою та головним болем. В особливо важких випадках можливий смертельний результат, викликаний присутністю в розчині пірогенів - речовин бактеріального походження. Пірогени - живі мікроорганізми і продукти їх життєдіяльності, тіла мертвих бактерій, які можуть перебувати в розчинах після стерилізації. Пірогенні речовини прийнято поділяти на екзогенні (в основному бактеріальні) та ендогенні (клітинно-тканинні). Джерелом ендогенних пірогенів можуть бути лейкоцити і білки крові, які в певних умовах утворюють і виділяють біологічно активні речовини з пірогенними властивостями (лейкопірогени).

З хімічної точки зору пірогени - це складні речовини з високою молекулярною масою і розміром частинок від 50 до 1 мкм, що складаються в основному з ліпополісахаридів, адсорбованих на білковому носії. Наприклад, хімічний склад пірогенної речовини, виділеного з Proteus Vulgaris, складається з вуглецю (25,83%), водню (6,06%), азоту (6%), фосфору (0,29%) і золи (8,33% ).

Пірогени розчиняються у воді, нерозчинні в спирті і ацетоні, стійкі до впливу підвищеної температури. Нагрівання в автоклаві при 120 ° С протягом 20 хв призводить до загибелі бактерій, але не знищує пірогени. Чутливість пірогенів до високої температури різна. Зміна pH водного розчину практично не впливає на термолабільність пірогенів. У сухому вигляді їх повне розкладання відбувається тільки при температурі 200 ° С протягом 30 хв; стерилізація сухим повітрям при 160 ° С протягом 2 год не гарантує повної апірогенності. Підвищення температури дозволяє скоротити час, необхідний для знищення пірогенів. При температурі 600 ° С достатньо хвилинного нагрівання, при 450 ° С - двуххвилинного, отже, звільнити від них воду та ін'єкційні розчини термічної стерилізацією практично неможливо.

Пірогенні речовини чутливі до дії окислювачів, наприклад, перекису водню або перманганату калію.

Пірогени володіють дуже малими розмірами і проходять через самі щільні фільтри з розмірами пор від 0,005 до 0,001 мкм.

Існують різні методи виявлення і видалення пірогенів з розчинів.

2.2 Методи виявлення пірогенів

Для практичних цілей, поряд з методами видалення пірогенних компонентів, велике значення мають методи їх виявлення:

а) хімічні;

б) фізичні;

в) біологічні.

Хімічні методи засновані на проведенні певних кольорових реакціях.

Фізичні методи засновані на вимірі електропровідності і полярографічних максимумів.

Через низку недоліків перших двох методів найчастіше застосовують методи біопроб, які введені в Фармакопеї різних країн світу.

Біологічні методи. До теперішнього часу основним і офіційно прийнятим у всіх країнах методом випробування лікарських засобів на наявність пірогенних домішок вважається метод, заснований на триразовому вимірюванні температури тіла кролика після внутрішньовенного введення досліджуваного препарату. Підвищення температури на 0,6 ° С або більше, згідно з вимогою фармакопей, вважається доказом наявності пірогенов.

Спеціальні статті Фармакопей обговорюють умови проведення цього випробування, оскільки фактори - хімічний (корм), фізичний (зміна температури навколишнього середовища), фізіологічний (збудження тварин при анальному вимірі температури) - можуть вплинути на результат випробування. І навіть при самому суворому дотриманні вимог до проведення випробувань неможливо уникнути випадкових помилок, пов'язаних з індивідуальною чутливістю тварин до пірогенності і препарату, різними кліматичними умовами, часу постановки досвіду і т. П. Все це може відбитися на показниках температури, виміряної з точністю до ± 0,1 ° С.

Згідно з даними різних Фармакопей доза одного і того ж препарату в ряді випадків коливається в широких межах. Дуже часто при рівних або дуже близьких дозах препаратів обсяги вводяться розчинів розрізняються в 5 разів. Відзначено, що спостерігається великий розрив між дозами для кроликів і людини. Нерідко ці дози розрізняються в 100-6000 разів. На думку вчених, які вивчали це питання, тест-доза препарату при випробуванні пірогенності повинна підбиратися індивідуально, враховуючи його фармакологію, переносимість кроликом, і орієнтовно має становити 1/10 максимальної добової дози для людини.

Існує варіант умов визнання препарату пірогенним або алірогенним: воду або розчин лікарського засобу вважають апірогеним, якщо сума максимальних підвищень температур у 3 кроликів не перевищує 1,2 ° С, і пірогенним, якщо вона дорівнює або більше 2,2 ° С. Якщо сума підвищень температури у 3 кроликів більше 1,2 ° С, але менше 2,2 ° С, то випробування повторюють на 5 кроликах. Воду або розчин лікарського засобу вважають пірогенним, якщо сума підвищень температури у 8 кроликів дорівнює або більше 3,8 ° С, в іншому випадку - апірогеним.

Останнім часом помітне поширення набуває метод випробування лікарських засобів на пірогенність in vitro з використанням лізата амебоцитів краба Лімулюс. Цей метод має ряд переваг перед фармакопейним: він чутливіше в 5-10 разів, результат виходить швидше, можливо кількісне визначення пірогену. Крім того, з його допомогою можливий контроль препаратів, які не можна випробувати на кроликах. Одним з недоліків цього методу є його специфічність відносно ендотоксину грамнегативних бактерій, т. Е. Небезпека не виявити наявність в лікарських засобах пирогенов іншого походження.

2.3 Методи видалення пірогенних речовин

Методи депірогенізаціі поділяються на:

1. хімічні;

2. фізичні;

3. ензиматичні.

Хімічні методи видалення пірогенів. Розчини, які містять пірогени, нагрівають при 100 ° С протягом 2 год з добавкою 0,1 благаючи перекису водню. Ефективний спосіб нагріву розчинів при температурі 116 ° С протягом 20 хв з добавкою 0,04 моля перекису водню.

Ряд методів заснований на застосуванні розчину перманганату калію. Рекомендується додавати до розчину невелику кількість гіпохлориду (щавлевої води): на 1 л додають 0,25 мл розчину гіпохлориду натрію з вмістом активного хлору близько 0,5%, суміш витримують 30 хв. Надлишок гіпохлориду видаляють за допомогою активованого вугілля (з розрахунку 15% від об'єму води). Для видалення пірогенів пропонується також обробляти розчини п-хінони та антрахинонов, що утворюють з пірогенами комплексні сполуки.

Для знищення пірогенних речовин можна використовувати підігрів розчину з 0,1Н розчином їдкого натру або 0,1Н розчином соляної кислоти (при рН 4,0) протягом 1 ч. Відбувається гідролітичні розщеплення пирогенов з утворенням моносахаридів, що не володіють пірогенними властивостями. Витрата кислоти і луги при цьому дуже великий, тому даний метод слід назвати неекономічним.

Через можливу взаємодію компонентів, хімічний та ензиматичний методи мало прийнятні при промисловому виготовленні розчинів для ін'єкцій.

Фізичні методи. Ґрунтуються на явищі адсорбції пірогенів активованим вугіллям, каоліном, азбестом, целюлозою і т. П. Кількість пірогенних речовин зменшується після обробки активованим вугіллям шляхом струшування протягом 15 хв, при цьому ефективність очищення залежить від природи пірогенних речовин. Гранульоване вугілля менш ефективне. Вугілля, застосовуване для очищення розчинів, повиненно бути ретельно очищене, добре промите водою, не містити пірогенів і висушене при температурі 250 ° С протягом 2 ч. Однак обробка розчинів активованим вугіллям не завжди призводить до повної депірогенізаціі. Крім того, даний метод не можна застосовувати для очищення розчинів лікарських речовин, легко адсорбованих вугіллям, наприклад, солей алкалоїдів, або легко окиснюваних, наприклад аскорбінової кислоти.

Ряд авторів рекомендують для очищення від пірогенів використовувати іонообмінні смоли (наприклад, для амінокислот), вважаючи, що вони більш ефективні, ніж активоване вугілля. Депірогенізацію води можна здійснити шляхом фільтрування через бактеріальний фільтр Зейтца. Розмір пор багатьох бактеріальних фільтрів такий же, як у фільтра Зейтца, але вони не придатні для видалення пірогенних речовин, тому не можна пояснити ефективність видалення пірогенних речовин тільки малим діаметром пор. Рекомендується, щоб діаметр пор фільтра Зейтца не перевищував 2,4 мкм. Фільтр Зейтца затримує пірогенні речовини з розчину на 99,5%, навіть коли вони знаходяться в значній кількості. Чим менше концентрація пірогенних речовин в розчині, тим краще вони затримуються на фільтрі.

Обробка розчину активованим вугіллям з наступним фільтруванням через фільтр Зейтца забезпечує більш повне видалення пірогенних речовин.

Для видалення пірогенних речовин з розчинів амінокислот, застосовуваних для внутрішньовенного вливання, пропонується їх автоклавування при температурі 120 ° С протягом 2-3 год в атмосфері азоту.

Зменшення пірогенних речовин відбувається при термічній стерилізації протягом 20 хв при 120 ° С, а при 140 ° С протягом 20 хв настає їх інактивація. Повне знищення пірогенних речовин досягається стерилізацією в сушильній шафі при температурі 200 ° С протягом 45 хв або при 250 ° С протягом 30 хв. При температурі 120 ° С пірогенність зменшується в процесі автоклавування на наступні величини: протягом 30 хв на 25, 1 ч - на 70, 2 ч - на 95, 4 год - на 100%.

До фізичних методів видалення пірогенів з розчинів слід віднести знищення їх за допомогою ультразвуку з частотою 2 МГц і інтенсивністю 2 Вт / см2 протягом 10 хв. При цьому досягається повне руйнування пірогенних речовин. У той же час ультразвук в 800 МГц і інтенсивністю 1,5 Вт / см2 протягом 5 10 хв незначно знижує пірогенність води. При дії ультразвуку рН води змінюється на ± 0,75.