Практическая часть

Лабораторная работа №1.

Определение уровня пролиферативной активности опухоли методом иммуногистохимии

Принцип метода: определение уровня пролиферативной активности опухоли определяется на основе маркера пролиферации Ki-67. С помощь моноклональных антител против человеческого Ki-67 биопсийную ткань опухоли (например, рака молочной железы) человека окрашивают методом иммуногистохимии. После чего, под световым микроскопом оценивают количество опухолевых клеток с позитивным ядерным окрашиванием на Ki-67 и считают процент от общего числа опухолевых клеток. Расчет проводится на 1000 клеток.

Реагенты и оборудование:

1. Ксилол;

2. Спирт этиловый 96%;

3. Дистиллированная вода;

4. Реагент, блокирующий пероксизаду (EnVision^TM FLEX Peroxidase-Blocking Reagent) Фосфатный буфер, содержащий перикись водорода, 15 мМол/л азид натрия и детергент;

5. Меченый полимер (молекула декстрана, меченая пероксидазой) с козьими анти-кроличьими и анти-мышиными иммуноглобулинами в буфере, содержащем белок-стабилизатор и антимикробный агент (EnVision^TM FLEX/HRP);

6. 3,3’- диаминобензидин тетрагидрохлорид, раствор (EnVision^TM FLEX DAB+ Chromogen ) Цвет реагента может варьировать от насыщенного фиолетового до бесцветного (без влияния на качество окраски при применении набора).

7. Раствор забуференного субстрата, содержащий перекись водорода и консервант (EnVision^TM FLEX Substrate Buffer);

8. ТРИС/ЭДТА буфер, pH 9 x 30 мл, концентрат х50 (EnVision^TM FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x);

9. Раствор Трис-буфера, содержащий Трин 20, рН 7,6 (±0,1), концентрат х20 (EnVision^TM FLEX Wash Buffer (20x));

10. Мышиные моноклональные антитела против Ki-67 человека (клон MIB-1), готовые к работе;

11. Модуль предподготовки PT Link;

12. Отрицательный контроль для соответствующих антител;

13. Водный раствор гематоксилина;

14. Лабораторная посуда и инструменты;

15. Предметные стекла;

16. Заключающая среда и покровные стекла;

17. Световой микроскоп.

Подготовка реагентов

1 Раствор для демаскировки антигенов, высокий pH (50x)

Развести необходимое количество Раствора для демаскировки 1:50 используя дистиллированную или деионизованную воду. Неиспользованный разведенный раствор может храниться при температуре 2-8 ^оС 1 месяц. При работе с модулем предподготовки PT Link разведение может быть осуществленно следующим образом: содержимое флакона выливается в пустую ёмкость и доливается водой до линии Fill Line. Полученный раствор может быть использован 3 раза в течение 5 дней при хранении при комнатной температуре.

2 Промывающий буфер (20х)

Развести необходимое количество промывающего буфера 1:20 используя дистиллированную или деионизованную воду. Рекомендуется добавлять необходимое количество концентрата к воде. Осторожно перемешать. Неиспользованный разведенный раствор можно хранить при температуре 2-8^оС 1 месяц. При помутнении раствора больше его не использовать. При работе с модулем предподготовки PT Link раствор может быть использован 3 раза в течение 5 дней при хранении при комнатной температуре.