3 Рабочий раствор субстрата

Содержащий ДАБ рабочий раствор субстрата готовится путем перемешивания 1 капли ДАБ+ хромогена и 1 мл субстратного буфера. Готовьте только необходимое количество раствора. Используйте приготовленный раствор в течение 5 дней (при хранении в темноте при 2-8^оС).

Сбор и подготовка образцов

Могут использоваться фиксированные формалином или замороженные образцы.

Образцы НЕ ДОЛЖНЫ фиксироваться в нейтральном формалине более 24 часов.

Оптимальная толщина залитых в парафин срезов – 4 мкм.

Оптимальная толщина замороженных срезов – 4-6 мкм.

Образцы без складок должны быть помещены на предметные стекла.

Процедура окрашивания

А. Процедура предподготовки

Рекомендуется 3-в-1 процедура с использованием модуля предподготовки PL Link

Депарафинизация, регидратация и тепловая демаскировка (восстановление) антигена могут быть проведены на фиксированных формалином, залитых в парафин образцах тканей, используя метод 3-в-1:

1. Подготовить рабочее разведение Буфера для демаскировки (разведение 1:50 в дистиллированной или деионизованной воде).

2. Заполнить емкости модуля предподготовки (1,5 л) рабочим раствором так, чтобы покрыть стекла с образцами.

3. Запустить PT модуль, чтобы нагреть раствор до 65оС.

4. Парафинизированные образцы тканей инкубировать 20-40 минут при температуре 97оС.

5. Оставить образцы остывать в PT модуле до 65оС.

6. Держатели со стеклами переместить в емкость с разведенным промывающим раствором при комнатной температуре.

7. Оставить стекла в промывающем буфере на 1-5 минут.

В. Процедура окраски

1. Обводим срезы гидрофобным карандашом и наносим реагент блокирующий эндогенную пероксидазную активность (Peroxidase blocking reagent производитель фирма “Dako”) – 5 минут.

2. Помещаем стекла со срезами в дистиллированную воду – 1 порция 5 минут.

3. Промываем стекла со срезами в фосфатном буфере - 1 порция 5 минут.

4. Наносим первичные антитела на 30 минут, при температуре 25ºС .

5. Промываем стекла со срезами в промывочном фосфатном буфере – 2 порции по 5 минут.

6. Наносим компонент системы визуализации полимер (EnVisionTM FLEX/HRP) – на 30 минут при температуре 25ºС.

7. Промываем стекла со срезами в промывочном фосфатном буфере – 2 порции по 5 минут.

8. Далее, наносим раствор диаминобензидина. - на 5 минут (контролируем появление окраски/ход реакции под микроскопом).

9. Промываем стекла со срезами в водопроводной воде – 10 минут.

10. Докрашиваем срезы гематоксилином - 10 секунд.

11. Помещаем стекла с окрашенными срезами в водопроводную воду на 10 минут.

12. Проводим стекла со срезами по спиртам (96º) – 3 порции по 5 минут.

13. Проводим стекла со срезами по толуолу – 3 порции по 5 минут.

14. Далее заключаем срезы в канадский бальзам.

15. Маркируем стекла согласно протоколу.

Контроль качества

Каждый раз при иммуногистохимическом окрашивании следует использовать положительный контроль для определения качества работы используемых реагентов. Если на контрольном образце не выявляется окрашивание, следует признать недействительными результаты окрашивания всех остальных образцов.

Отрицательный контроль следует использовать для выявления неспецифического окрашивания.

Интерпретация результатов

Окрашивание рабочим раствором диаминобензидина дает коричневое окрашивание в месте соединения антигена-мишени с антителами. В случае специфического окрашивания коричневый цвет, так же как на контрольном слайде (положительный контроль), наблюдается в месте ожидаемой локализации искомого антигена. В случае неспецифического окрашивания, наблюдается диффузное окрашивание в коричневый цвет по всему слайду, следует сравнить образец с отрицательным контролем. Ядра клеток должны быть окрашены в синий цвет после докрашивания гематоксилином.