2.2. Методи дослідження Визначення смертності

Показники смертності науплій визначали на 6, 12 та 24 години від початку насичення. Для цього за допомогою бінокулярного мікроскопа вираховували кількість мертвих та живих особин в 1мл середовища. Смертність виражали у % мертвих особин до загальної кількості всіх відібраних особин.

Визначення біохімічних показників

Визначення біохімічних показників проводили на 2 експериментальній і контрольній групах. Відібрані для дослідження зразки, після попереднього просушування на фільтрувальному папері, зважували на аналітичних терезах з точністю до четвертого знака після коми і заморожували у рідкому азоті.

Гомогенізацію дослідного матеріалу проводили при температурі 4°С з використанням фосфатного буфера рН 7,4. Гомогенат центрифугували при 1500 g протягом 15 хв.

Всі розрахунки проводили в перерахунку на суху масу. Для цього дослідні зразки висушували при 60°С протягом 24 годин до досягнення ними постійної ваги.

Визначення вмісту загальних білків за методом Лоурі

Метод Лоурі базується на утворенні забарвлених продуктів синього кольору, які утворюються внаслідок двох самостійних реакцій: біуретової реакції купрум-іонів з пептидними зв’язками в лужному середовищі та реакції відновлення фосфатномолібденової та фосфатновольфрамової солей реактиву Фоліна.

Реактиви:

Реактив А: 1г NaOH + 5г Na₂CO₃ , доводили до 250 мл H₂O

Реактив В: 0,5г цитрату Na + 0.25г CuSO₄∙5H₂O, доводили до 50 мл H₂O

Реактив С: 50мл реактиву А + 1мл реактиву В

Реактив Е: розведений реактив Фоліна (1:1)

Наважку артемії гомогенізували у фосфатному буфері рН 7,4. До 0,1 мл досліджуваного розчину додавали 0,9 мл H₂O, потім 2 мл реактиву С, перемішували та витримували 10 хв. Додавали 0,2 мл реактиву Е та ставили на 30 хв. в темряву. Для контролю брали 1мл H₂O, додавали 2 мл реактиву С та 0,2 мл реактиву Е. Колориметрували при λ=750 нм в кюветах товщиною 0,5 мм. Розрахунок здійснювали за калібрувальною кривою, побудованою з використанням бичачого сироваткового альбуміну.

Визначення вмісту загальних ліпідів

Принцип методу полягає у тому, що продукти розпаду ненасичених ліпідів після гідролізу сірчаною кислотою, взаємодіють з фосфорнованіліновим реактивом з утворенням забарвленої сполуки, що має максимум поглинання при довжині хвилі 530 нм.

Реактиви:

1. Сірчана кислота

2. Фосфорнованіліновий реактив

0,01 мл досліджуваного розчину вносили у пробірку, додавали 1 мл сірчаної кислоти. Вміст пробірок струшували і нагрівали на киплячій водяній бані 10 хв. Після охолодження пробірок упродовж 5 хв холодною водою відміряли у пробірки 2 мл фосфорнованілінового реактиву. Вміст змішували, інкубували 25 хв у темряві. Для контролю брали 1 мл сірчаної кислоти та 2 мл фосфорнованілінового реактиву. Колориметрували при λ=530 нм в кюветах товщиною 0,5 мм.

Розрахунок здійснювали за формулою: ;

С – концентрація загальних ліпідів в дослідній пробі, г/л;

Е_дос – оптична щільність дослідної проби, одиниці оптичної щільності;

Е_кал – оптична щільність калібрувальної проби, одиниці оптичної щільності;

8,0 – концентрація загальних ліпідів у калібрувальному розчині, г/л.