Визначення протеолітичної активності

Метод заснований на гідролізі білка препаратом ферменту, що знаходиться в досліджуваному розчині, з наступною інактивацією ферменту і осадженням непрогідролізованого білка ТХО.

Реактиви:

Казеїн 2%

Гемоглобін 1%

17% ТХО

0,5М Na₂CO₃

Реактив Фоліна

Визначення протеолітичної активності проводили при різних значеннях рН. Для визначення кислих протеаз в якості субстрату використовували гемоглобін, а для нейтральних та лужних – казеїн.

Казеїнолітична активність: 2 г казеїну розчиняли в 90 мл буферного розчину рН 7,4, кип’ятили на водяній бані 30 хв, охолоджували та доводили до 100 мл.

Гемоглобінолітична активність: 1% гемоглобін розчиняли буферним розчином рН 4,8, додавали 6% сечовину, інкубували 1 годину.

Для досліду брали 1 мл субстрату додавали 2 мл дослідного розчину. Для контролю 1 мл субстрату, 4 мл ТХО та 2 мл дослідного розчину. Інкубували 30 хв при 30°С. Після цього у дослідну пробу додавали 4 мл ТХО. Вміст пробірки центрифугували протягом 15 хв.

Відбирали 1 мл надосадового розчину додавали 5 мл Na₂CO₃ та 1 мл реактиву Фоліна. Інкубували 30 хв у темряві.

Холоста проба містила 1 мл буферного розчину, 5 мл Na₂CO₃ та 1 мл реактиву Фоліна.

Колориметрували при 670 нм в кюветах товщиною 10 мм проти холостої проби.

Розрахунок проводили за формулою:

;

D – величина оптичної щільності, D = D_дос. − D_кон.;

V – об’єм проби з ТХО, мл;

V_поч. – об’єм гомогенату, мл;

30 – час інкубації при 30°С, хв.

Визначення ліполітичної активності

Метод полягає в спектрофотометричному вимірюванні зміни помутніння суспензії маслинової олії за дії ліпази. Активність ензиму пропорційна кількості жирних кислот, що утворюються під час гідролізу.

Реактиви:

Буфер, рН 8,8, який містить ТРИС і натрієву сіль дезоксихолевої кислоти

Етиловий спирт абсолютний

Основний розчин маслинової олії (100 мл абсолютного спирту та 1,1 мл маслинової олії)

Робоча емульсія масливої олії (1,5 мл основного розчину маслинової олії та 10 мл буферу рН 8,8)

Перед визначенням дослідний розчин та реактиви прогрівали до температури визначення. У кювету наливали 3 мл робочої емульсії маслинової олії і додавали 0,1 мл дослідного розчину, перемішували і ставили у термостат при 30 або 37°С. Через 2 хв вимірювали екстинцію проти води при довжині хвилі 340 нм у кюветі з товщиною шару 10мм. Потім кювету знову ставили у термостат при тій температурі, що й першого разу. Через 5 хв вимірювали екстинцію.

Розрахунок проводили за формулою: ;

Е – зміна екстинції дослідної проби за 1 хв ( [(Е₂ – Е₁)/5]);

170 – концентрація маслинової олії в робочій емульсії (кмоль/л), за якої екстинція = 1;

Е_к – екстинція робочої емульсії маслинової олії;

3/1000 – об’єм робочої емульсії маслинової олії, л;

1000/0,1 – коефіцієнт перерахунку на 1 л дослідного розчину.

Визначення активності амілази амілокластичним методом Каравея

Амілаза каталізує розщеплення полісахариду крохмалю до декстринів і мальтози (продукти, що надають кольорової реакції з йодом). Активність ферменту визначають по зменшенню оптичної густини розчину субстрату після його гідролізу ферментом.

Реактиви:

Буферний розчин, рН 7,1 (фосфатний буфер, хлорид натрію)

Розчин крохмалю (10,0±0,2) мг/мл

Розчин йоду (0,100±0,002) N

Розчин фториду калію (56,0±1,1) г/л

Приготування робочих розчинів:

• Субстратно–буферний розчин. Змішували розчин крохмалю і розчин буферу в співвідношенні 1:24.

• Розчин йоду з концентрацією 0,01 N. Розчин йоду змішували з розчином фториду калію у співвідношенні 1:10.

Розчини готували в день проведення аналізу.

Для досліду та контролю у пробірку вносили 0,5 мл субстратно-буферного розчину. Інкубували 5 хв при 37°С у водяному термостаті. Далі тільки в дослідну пробу вносили 0,01 мл гомогенату. Інкубували точно 7,5 хв при 37°С. Потім додавали 0,5 мл розчину йоду, 4 мл дистильованої води та 0,01 мл гомогенату (в контрольну пробу).

Оптичну густину проб вимірювали проти дистильованої води при 640 нм в кюветі товщиною 10 мм.

Розрахунок проводили за формулою: ;

160,0 – коефіцієнт перерахунку на кількість крохмалю в грамах гідролізованого в аналізуємій рідині в 1 л за 1 год інкубації;

Е_хол – оптична густина холостої проби, одиниці екстинції;

Е_дос – оптична густина дослідної проби, одиниці екстинції.