18. Доказательство полуконсервативного способа репликации днк Мэтью Мезельсоном и Франклином Сталем в 1958 г

Эксперимент Мезельсона-Сталя  показал, что репликация ДНК имеет полуконсервативный характер. Это означает, что каждая дочерняя двойная спираль ДНК состоит из одной старой (матричной) цепи и из одной вновь синтезированной цепи.

В 1957 Мезельсон, Сталь и Джером Виноград опубликовали статью о новом м-де изучения молекулярного веса и парциального удельного объёма макромолекул(напр,ДНК)-равновесном ультрацентрифугиро-вании в градиенте плотности. Этот м-д позволяет разделять мол-лы ДНК по их плотности: каждая молекула остановится в месте градиента, где плотность р-ра совпадает с её плавучей плотностью. Авторы применили этот метод для разделения молекул ДНК, содержащих изотопы азота 14N и 15N. Содержащие тяжелый изотоп молекулы ДНК функциональны и могут удваиваться.

Мезельсон и Сталь показали, что если вырастить несколько поколений бактерий E. coli в среде, богатой 15N или 14N, затем центрифугировать их ДНК в градиенте плотности хлористого цезия, то окажется, что более тяжёлая 15N-ДНК останавливается ближе ко дну центрифужной пробирки, чем 14N-ДНК.

Для того чтобы установить механизм репликации, E. coli, которые в течение нескольких поколений росли в 15N-содержащей среде (а значит их ДНК содержала только 15N) были перенесены в 14N-содержащую среду, где им было позволено разделиться только один раз. Плотность выделенной из этих клеток ДНК оказалась больше плотности ДНК бактерий, выращенных в среде, богатой 14N, но меньше плотности ДНК бактерий, выращенных в 15N среде. Это противоречило гипотезе о консервативном хар-ре репликации ДНК, при котором ДНК разделились бы на 2 фракции с высокой и низкой плотностью,но не с промежут. Т.о,первая гипотеза была отброшена.

Однако полученный результат не исключал дисперсный механизм репликации, при котором участки материнской ДНК чередуются с участками дочерней ДНК. Чтобы выяснить, какой из оставшихся механизмов верен, была проанализирована плотность ДНК второго поколения бактерий. По гипотезе дисперсной репликации плотность ДНК второго поколения бактерий должна быть одинаковой для всех молекул и занимать промежуточное положение между плотностью ДНК клеток первого поколения и плотностью самой лёгкой ДНК. Оказалось, однако, что клетки второго поколения содержали примерно равные количества лёгких и гибридных ДНК. Этот факт позволил исключить гипотезу дисперсного механизма репликации.

19. Характеристика процесса репликации

Репликация ДНК— ключевое событие в ходе деления клетки. Принципиально, чтобы к моменту деления ДНК была реплицирована полностью и при этом только 1 раз. Это обеспеч-ся определёнными мех-ми регуляции репликации ДНК.Репликация проходит в 3 этапа:

---инициация репликации ---элонгация ---терминация репликации.

Регуляция репликации осуществляется на этапе инициации. Это легко осуществимо, потому что репликация может начинаться не с любого участка ДНК, а со строго определённого-сайта инициации репликации. В геноме таких сайтов м.б.как один, так и много. Репликон —участок ДНК, содержит сайт инициации репликации и реплицируется после начала синтеза ДНК с этого сайта. Геномы бактерий представляют собой один репликон - репликация всего генома является следствием всего 1 акта инициации репликации. Геномы эукариот (и их отдельные хромосомы) состоят из большого числа самостоятельных репликонов, это значит.сокращает суммарное время репликации отдельной хромосомы. Молекулярные механизмы, которые контролируют количество актов инициации репликации в каждом сайте за один цикл деления клетки -контроль копийности. В бакт.клетках помимо хромосомной ДНК часто содержатся плазмиды, кот.представляют отдельные репликоны.У плазмид существуют свои механизмы контроля копийности: они могут обеспечивать синтез как всего 1 копии плазмиды за клеточный цикл, так и тысяч копий.

Репликация начинается в сайте инициации репликации с расплетания двойной спирали ДНК, при этом формируется репликационная вилка — место непосредственной репликации ДНК. В каждом сайте может формироваться одна или две репликационные вилки в зависимости от того, является ли репликация одно- или двунаправленной. Более распространена двунаправленная репликация. Через некоторое время после начала репликации в электронный микроскоп м.наблюдать репликационный глазок — участок хромосомы, где ДНК уже реплицирована, окружённый более протяжёнными участками нереплицированной ДНК. В репликационной вилке ДНК копирует крупный белковый комплекс (реплисома), ключевым ферментом кот. является ДНК-полимераза. Репликационная вилка движется со скоростью 100 000 п. н.в минуту у прокариот и 500-5000-у эукариот.