§1.1.3. Выделение и первичная идентификация

При поступлении пробы исследуемого материала в лабораторию должны быть приняты меры по обеспечению наиболее благоприятных условий для выделения из нее искомых микроорганизмов. Следует по возможности скорее приступить к посеву материала в питательные среды, также чрезвычайно важны правильный выбор сред для первичного посева, их качественное приготовление, соблюдение правил техники посева и необходимого режима инкубации посевов. До момента посева подлежащий исследованию материал необходимо сохранять в прохладном месте, огражденном от прямых солнечных лучей. Из плотных сред, производящихся в нашей стране, высокоселективным действием в отношении сальмонелл обладает висмут-сульфит агар. Селективными средами для выделения шигелл служат среды с антибиотиками, а для одновременного выделения и сальмонелл, и шигелл - агар Плоскирева. В числе коммерческих отечественных сред - агар с эозин- метиленовым синим и Эндо, будучи слабоселективными, являются в основном дифференциальными средами. Исследуемую пробу материала засевают прямым посевом в чашки с плотными селективно-дифференциальными средами и одновременно в жидкую среду обогащения с последующим высевом из нее на указанные пластинчатые среды. На плотные высокоселективные среды, включая среды с антибиотиками, посевного материала наносится больше, чем на слабоселективные. При одновременном применении сред обоих типов для высева материала из одной и той же пробы посев на слабоселективную сроду может быть сделан шпателем, использованным перед этим для посева на высокоселективную среду, т.е. без внесения в нее новой порции материала.

Для посева на плотные питательные среды используют стеклянный шпатель или проволоку (желательно платиновую), вмонтированную в специальную рукоятку, которая заканчивается петлей. При посеве на поверхность агара у края чашки наносят 1-2 капли исследуемого материала и растирают его непрерывными движениями шпателя на небольшом участке агара, после чего, оторвав шпатель от поверхности, продолжают растирание им же на оставшейся не засеянной части среды. Поверхность агара в чашке Петри может быть также засеяна петлей. Нанесенный у края чашки исследуемый материал распределяют поочередно на каждой секторной четверти агара непрерывными движениями петли из стороны в сторону, повертывая чашку под углом 90 градсов. Перед каждым последующим сектором петля должна стерилизоваться, благодаря чему достигается рост изолированных колоний. В среды с бумажными полосками, пропитанными антибиотиками, посевной материал наносят на агар в зоне полосок, распределяя его вначале в этой зоне, а затем по остальной поверхности агара. Посев выращивают при температуре 37 С на пластинчатых питательных средах в течении 18-20 ч (48 ч на висмут-сульфит агаре), в средах обогащения максимальный срок инкубации посевов не должен превышать 18 ч (кроме желчи и крови). Это связанно с тем, что обычно селективные среды обогащения недостаточно токсичны, что бы полностью подавить рост эшерихий, энтерококков и других непатогенных микроорганизмов. Однако в первые 8-12 ч в селективной среде число эшерихий снижается, а после 12 ч эти бактерии начинают размножаться. Изучение и интерпретация характера роста на плотных средах как предварительный этап идентификации микроорганизмов требуют большой тщательности и определенного практического опыта. От начальной оценки колоний в первую очередь зависит исход бактериологического исследования. При этой оценке учитывают различные характеристики колоний, относительное число колоний каждого типа, чистоту культуры, видимые реакции в среде, наступающие в результате метаболизма бактерий.

Визуальную характеристику колоний получают, держа чашку в одной руке и осматривая поверхность агара на наличие микробного роста, а также просматривая его в проходящем дневном или искусственном свете. Во время осмотра чашку наклоняют в разных направлениях при достаточном освещении так, чтобы свет мог падать под различными углами; кроме того, можно применять также ручную лупу. В числе характеристик колоний учитывают их размер (диаметр в милиметрах), форму, возвышение над поверхностью (плоская, выпуклая), особенности края (ровный, волнистый и др.) и поверхности (блестящая, матовая и т.д.) цвет, плотность (прозрачная , мутная) и консистенцию (вязкая, пленчатая и др.) Обращают также внимание на возможное образование пигмента, наличие спецефического запаха, изменение цвета среды. Все эти признаки колоний и другие культуральные свойства энтеробактреий различных родов подробно описываются в соответствующих главах. Решающее значение при оценке роста энтеробактерий на пластинчатых средах имеет дифференциация по окраске изолированных колоний, зависящих от отношения бактерий к дифференцирующим компонентам сред.

В качестве дифференцирующих субстратов в средах для выделения энтеробактерий используют углеводы, аминокислоты и др., утилизация которых выявляется с помощью различных индикаторов. Дифференцирующим субстратом в среде Плоскирева, Эндо, Мак Конки служит лактоза, по отношению к которой отличают бесцветные колонии бактерий, не ферментирующих этот углевод (шигеллы, сальмонеллы и др.), от окрашенных колоний бактерий, обладающих этой способностью (большинство эшерихий, клебсиелл, энтеробактеров, некоторые представители цитробактеров и др.) Единственным, дифференцирующим признаком на висмут-сульфит агаре служит образование серовадорода, при наличии которого колонии имеют черную окраску с металическим блеском и характерное почернение среды под ними; некоторые сальмонеллы формируют колонии с зеленой окраской различной интенсивности и разных оттенков. В некоторых средах использованы сложные дифференцирующие системы, дающие возможность по двум или нескольким признакам различать колонии большего числа представителей энтеробактерий.