Билет 6

На Третьем съезде Европейской ассоциации биотехнологов (Мюнхен, 1984 г.) голландский ученый Е. Хаувинк разделил историю биотехнологии на пять периодов, или эр.

(до 1865 г.) Допастеровская эра Использование спиртового и молочнокислого брожения при получении пива, вина, хлебопекарных и пивных дрожжей, сыра. Получение ферментированных продуктов и уксуса

(1866--1940 гг.) Послепастеровская эра Производство этанола, бутанола, ацетона, глицерола, органических кислот и вакцин. Аэробная очисткаканализационных вод. Производство кормовых дрожжей из углеводов

{1941 -- 1960 гг.) Эра антибиотиков Производство пенициллина и других антибиотиков

путем глубинной ферментации. Культивирование растительных клеток и получение вирусных вакцин. Микробиологическая трансформация стероидов

(1961 -- 1975 гг.) Эра управляемого биосинтеза Производство аминокислот с помощью микробных мутантов. Получение чистых ферментов. Промышленное использование иммобилизованных ферментов и клеток. Анаэробная очистка канализационных вод и получение биогаза. Производство бактериальных полисахаридов

(после 1975 г.) Эра новой биотехнологии Использование генной и клеточной инженерии в целях получения агентов биосинтеза. Получение гибридов, моноклональных антител, гибридов из протопластов и меристемных культур. Трансплантация эмбрионов

В XX веке учёным удалось расшифровать многие тайны природы, установить биохимическую и физико-химическую сущность жизненных процессов. Освоение новых биологических методов определяет развитие других наук. В биотехнологии наряду с микробиоломи, биохимиками работают вирусологи, генетики, цитологи, биофизики, электронщики, автоматчики, кибернетики.

Новая биотехнология началась после открытия Дж. Уотсоном и Ф. Криком строения генетического материала -- ДНК- Главным объектом исследований до сих пор остается живая клетка, но центральное место в биотехнологических экспериментах занимают, пожалуй, манипуляции с ДНК. Пользуясь методами гене-тической инженерии, создают искусственные, заранее запрограм-мированные генетические структуры в виде рекомбинантных молекул ДНК, осуществляют трансплантацию генов между раз-ными видами микробных клеток, а также между клетками одноклеточных и многоклеточных организмов. Пристальное внимание современных исследователей привлекают биологические мем-браны. Создана теория хемоосмотической циркуляции протонов в биологических мембранах.

Весьма многообразны биотехнологические манипуляции с клеточными структурами и протопластами. Например, в результате искус-ственного слияния лимфоцитов и меланомных клеток (разновид-ность опухоли) получены гибридомы, которые синтезируют моноклональные антитела, имеющие важное значение в иммуно-логических реакциях. Учение о моноклональных антителах -- важный раздел современной биотехнологии.

В 1972 г. Дж. Эдельманом, Р. Портером установлен химический состав антител -- важного фактора иммунологической си-стемы человека и животных. В 1975 г. путем гибридизации сома-тических клеток получены гибридомы, секретирующие монокло-нальные антитела.

К числу последних достижений биотехнологии можно отнести разработанные А. С. Спириным основы бесклеточного синтеза белка в протоке, создание новых генно-инженерных сортов растений и животных, клонировании животных.

Генетические манипуляции, которые проводят в настоящее время с половыми клетками и эмбрионами животных, позволяют ускорить размножение высокопродуктивных животных для их дальнейшего клонирования. Важной составной частью биотехнологии является генетическая инженерия. В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 - 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается. Впоследствии в клетках E. coli был осуществлен синтез проинсулина, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного проинсулина его расщепили и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы.

2, ПРИНЦИПЫ ТЕХНОЛОГИЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК.Было выделено много рестриктаз(более 150),расщепляющих ДНК в специфическихсайтах. Например эндонуклеаза R1 регистрирует двухцепочную ДНК по двумсайтам таким образом, что образуются два липких конца

­

Липкие концы различных молекул ДНК, расщеплённых этим ферментом, могут

вступать по четырём –A-T-парам. Рестриктационные эндонуклеазы различаются по

тем сайтам ДНК, которые они распознают и разрезают. Их можно использовать

для различных целей. Однако наиболее распространенным этапом является их

применение для амплификации специфической определения нуклеотидных

последовательностей фрагментов ДНК, необходимо для ДНК или для изучения

механизмов экспрессии генов. Последняя проблема наиболее важна в практическом

аспекте: гены контролирующие образование функционально активных белков,

теперьможно вводить в бактерии и размножать(амплифицировать).эта процедура

называется клонированием генов. Благодаря ей, появилась возможность

вырабатывать в больших количествах белки, которые раньше удавалось получить

ничтожно мало. Эта технология основана на следующем принцепе: помимо своей

собственной кольцевой хромосомы, бактерии часто содержат дополнительные

маленькие кольцевидные молекулы двух цепочной ДНК,называемые плазмидами.

Плазмиды реплицируются автономо и сами могут содержать гены, определяющие

устойчивость бактерий к антибиотикам или контролирующие синтез веществ,

например: колицинов, убивающих другие бактерииПлазмидную ДНК можно выделить и ращепить подходящей рестриктазой только водном сайте, превратив кольцевую молекулу в линейную с липкими концами.Фрагменты любой чужеродной ДНК с такими же липкими концами(полученными

после разрезания аналогичной рестриктазой) можно сшить с плазмидой ДНК с

помощью лигазы. Клетка E-coli с хромосомой и плазмидой.

Принцип введения чужеродной ДНК в бактериальную плазмиду с

использованием эндонуклеазы.

3, Вопросы микроэкологии кишечника и ее нарушения – дисбактериоз, несмотря на длительность изучения этой проблемы, постоянно привлекают внимание специалистов различных областей медицины. И, вероятно, это прежде всего связано с обнаружением все новых и новых позитивных свойств микрофлоры, тесно связанной с организмом человека и перспективами биотерапии. У здоровых лиц в кишечнике насчитывается около 500 видов различных микроорганизмов, большую часть из которых составляют представители т.н. облигатной микрофлоры (бифидобактерии, лактобактерии, непатогенная кишечная палочка и др.)Нормальная микрофлора – это качественное и количественное соотношение разнообразных микробов отдельных органов и систем, поддерживающее биохимическое, метаболическое и иммунное равновесие макроорганизма, необходимое для сохранения здоровья человека.На 92–95% микрофлора кишечника состоит из облигатных анаэробов. Состав кишечной микрофлоры достаточно индивидуален и формируется в первые дни жизни ребенка. Нарушение микробного равновесия в кишечнике именуется дисбактериозом или дисбиозом кишечника. Основные причины дисбактериоза кишечника: – позднее прикладывание к груди; – нерациональное питание ребенка (особенно в первые месяцы жизни); – функциональные нарушения желудочно–кишечного тракта; – заболевания желудочно–кишечного тракта, особенно связанные с синдромом мальабсорбции (лактазная недостаточность, целиакия, муковисцидоз и др.);

– антибиотикотерапия (особенно в первые дни жизни);

– особенности иммунной системы. Эубиотики — биологически активные добавки к пище, в состав которых входят живые микроорганизмы и (или) их метаболиты, оказывающие нормализующее воздействие на состав и биологическую активность микрофлоры и моторику пищеварительного тракта; эубиотики подчас включают в себя и субстрат, способствующий росту дружественной флоры, но не усваиваемый человеческим организмом. Пробиотики — принятый синоним понятия «эубиотики», однако, под эту категорию вполне подпадают средства не содержащие живой флоры. Упомянутые средства ещё обобщают категорией «средства микроэкологической терапии».

Поликомпонентные Бифилонг, бификол, окарин, ацилакт, линекс, бифидин, бифинорм

Комбинированные (синбиотики)Бифидумбактерин форте, бифилиз, бифиформ, бактистатин, примадофилиус, полибактерин, пробифор, кипацид, аципол

 Рекомбинантные (генно-инженерные)Субалин