7.5. Учет результатов контроля стерильности

Посевы периодически просматривают в рассеянном свете и по окончании периода инкубации. Наличие роста микроорганизмов оценивается визуально по выявлению мутности, осадка, хлопьев и других микроскопических изменений. Выявленный рост микроорганизмов необходимо подтвердить микроскопированием мазков, окрашенных по Граму. В протоколах испытания отмечается: при какой температуре выявлен рост, его характер, морфологические признаки обнаруженных микроорганизмов, окраска по Граму.

Испытуемый препарат считают удовлетворяющим требованиям испытания на стерильность при отсутствии роста микроорганизмов во всех образцах. При обнаружении роста хотя бы в одной пробирке (колбе, флаконе) его подтверждают микроскопированием и повторяют испытание на стерильность на том же количестве образцов, что и в первый раз. При отсутствии роста микроорганизмов при повторном посеве испытуемый препарат считают удовлетворяющим требованиям испытания на стерильность. В случае роста микроорганизмов при повторном посеве, морфологически сходных с выявленными при первичном посеве, испытуемый препарат считают нестерильным.

Для готового препарата в полуфабрикате допускается только одно повторное испытание на стерильность. В случае обнаружения роста при испытании на стерильность готового препарата в полуфабрикате при повторении теста, независимо от характера микрофлоры, его бракуют.

Для готового препарата возможно проведение испытания на стерильность в третий раз на удвоенном количестве образцов, если в первый и во второй раз выявлен рост различных по морфологии микроорганизмов. При отсутствии роста микроорганизмов после инкубации в третьем испытании готовый препарат считают удовлетворяющим требованиям испытания на стерильность. При наличии роста хотя бы в одной пробирке (колбе, флаконе) испытуемый препарат считают нестерильным.

Результаты контроля исследуемых препаратов регистрируются в специальных производственных журналах.

7.6. Требования, предъявляемые к боксам

Испытание на стерильность МИБП должно проводиться квалифицированным персоналом в специальных, предназначенных только для данного вида работ, боксах с обеспечением строгих правил асептики.

Боксы представляют собой изолированные застекленные камеры достаточной площади и кубатуры для проведения в них бактериологических исследований. Боксы должны быть хорошо освещены и обеспечены вентиляцией. Оптимальным является оборудование боксов приточно-вытяжной вентиляцией с подачей стерильного кондиционированного воздуха и с преобладанием притока (не менее 1,27 мм водн. ст.). Скорость потока воздуха - 20 объемов в час.

Внутреннее устройство боксов должно обеспечивать легкость и надежность поддержания чистоты и возможность дезинфекционной обработки. С этой целью газовые и водопроводные трубы, а также электропроводку размещают вне бокса или в толще его стен. Отопительные батареи устанавливают гладкими без ребер, что препятствует осаждению пыли. Стены бокса на высоту не менее полутора метров от пола облицовывают метлахской плиткой, или, как и потолок, окрашивают в светлые тона масляной краской. Полы покрывают линолеумом, метлахской плиткой или пластиком. Такая отделка поверхностей позволяет использовать при уборке помещения дезинфицирующие растворы. В боксе должно находиться минимальное количество мебели - стол и табуреты. Запрещается размещение в боксах и предбоксниках водопроводных кранов и раковин, так как они являются источником грибковой микрофлоры.

Работу рекомендуется проводить в настольных ламинарных боксах с подачей стерильного воздуха в рабочую зону, что позволяет проводить исследования в условиях, исключающих возможность загрязнения испытуемого препарата.

Примечание. В боксах, предназначенных для проведения контроля стерильности МИБП, работа с живыми микробными культурами не допускается.

К боксу должен прилегать предбоксник, отделенный от него стеклянной перегородкой с дверью и передаточными окнами, - помещение, куда вносятся подготовленные для посевов препараты, питательные среды, пипетки и биксы со стерильной одеждой для работы. В предбокснике персонал переодевается в стерильную одежду и специальную обувь для боксов.

К предбокснику должна примыкать комната, где хранятся питательные среды, необходимые для работы, стерильная посуда. В этой комнате проводят всю вспомогательную работу (деконтаминация емкостей с МИБП, штативов для питательных сред, маркировка пробирок и т.п.).

Ежедневно бокс и предбоксник подвергаются тщательной уборке и деконтаминации путем протирания ветошью, смоченной в 3%-ной перекиси водорода с 0,5% сульфанола или порошка "Лотос". При приготовлении раствора воду добавляют в пергидроль, а затем моющее средство. Этот раствор используют после приготовления.

Для приготовления 10 л раствора берут следующие количества препаратов: 1200 мл пергидроля, 50 г моющего средства и 8750 мл воды при температуре от 40 до 50 °С. Для простоты приготовления используют вымеренную по объему ингредиентов посуду. Норма расхода дезинфицирующего раствора - 70 - 100 мл/кв. м.

Готовят раствор и обрабатывают бокс и предбоксник с соблюдением правил техники безопасности при работе с агрессивными веществами.

При отсутствии возможности использовать дезинфицирующий раствор производят обработку горячим (50 - 60 °С) мыльносодовым раствором (1% раствора соды или стирального порошка и 0,5% нашатырного спирта) с последующим протиранием стен, полов, мебели одним из следующих дезинфицирующих растворов:

- 2%-ный раствор хлорамина;

- 3%-ный раствор фенола;

- раствор антисептола.

Для приготовления антисептола берут 2 раствора: 50%-ный раствор хлорной извести и 5%-ный раствор кальцинированной соды. Перед употреблением растворы сливают в равных объемах и разбавляют в 50 раз водой. Работу с антисептолом производят в резиновых перчатках.

Для обеззараживания боксов и предбоксников применяют бактерицидные лампы БУВ, установленные из расчета: 1 лампа БУВ-30 на 12 куб. м объема воздуха или 2 - 2,5 ватта мощности на кв. м поверхности (числа в названиях ламп обозначают их мощность в ваттах). Лампы размещают на потолках или стенах на уровне 1,5 м от пола. Облучение бокса производят до начала работы в течение 1,5 - 2 ч. Во время работы лампы должны быть выключены. Необходимо учитывать время эксплуатации ламп и, по окончании гарантийного срока, заменять лампы новыми, если даже они продолжают "светить".

В боксах, оборудованных принудительной вентиляцией и ламинарными настольными боксами, работа должна начинаться не ранее чем через 30 мин. после их включения. Это минимальное время, необходимое для замены воздуха стерильным, удаления пыли поднявшимся потоком воздуха и установления стационарного потока воздуха.

Ежедневно в начале и в конце работы контролируют бактериальную чистоту воздуха в боксе и в предбокснике, используя метод седиментации. Для этого чашки Петри с питательным агаром и средой Сабуро помещают открытыми на 15 мин. в нескольких точках (например, рабочий стол, ламинарный бокс и вблизи вентиляции). Затем выдерживают в термостате 48 ч чашки с питательным агаром при температуре от 30 до 35 °С и 72 ч чашки со средой Сабуро при температуре от 20 до 25 °С. При появлении роста колоний делают мазки, окрашенные по Граму, микроскопируют их и отмечают характер микрофлоры в специальных журналах.

Допустимым считается рост не более 3-х колоний микробов сапрофитов на одной чашке. Рост большего числа колоний указывает на повышенную бактериальную загрязненность воздуха в боксе. В этих случаях необходимо произвести дополнительную дезинфицирующую уборку бокса и предбоксника, а также проанализировать случай увеличения бактериальной контаминации и наметить мероприятия по ее устранению. В случаях появления колоний грибов, помимо дезинфекции, обращают особое внимание на снижение влажности в боксе и предбокснике путем просушивания их электронагревательными приборами. При проявлении спорообразующих микроорганизмов, а также грибов при уборке помещения увеличивают концентрацию перекиси водорода до 6%.

У лиц, работающих в боксе, периодически проверяют степень бактериальной обсемененности рук после мытья. Эту проверку проводят следующим образом: пальцами рук прикасаются к поверхности плотной питательной среды в чашке Петри и делают несколько круговых движений, "засеянные" чашки помещаются в термостат при температуре 30 - 35 °С на 48 ч для питательного агара и при температуре 20 - 25 °С на 72 ч для среды Сабуро. Появление более 3-х колоний на одной чашке Петри указывает на недостаточную чистоту рук для проведения асептической работы.

Результаты проверки контаминации воздуха бокса и предбоксника, бактериальной обсемененности рук работников должны быть зафиксированы в специальных журналах.

Постоянно следует обращать внимание на надежность стерилизации используемых для работы инструментов, лабораторной посуды, дистиллированной воды и различных растворов. Должен быть налажен надежный контроль указанных материалов, а также тщательный контроль стерильности используемых питательных сред.

Приложение

Жидкость 1

пептона ферментативного 1 г

воды дистиллированной до 1000 мл

pH после стерилизации 7,1 +/- 0,2

Жидкость 2

пептона ферментативного 5 г

твина-80 10 г

воды дистиллированной до 1000 мл

pH после стерилизации 7,1 +/- 0,2

Жидкости разливают в колбы или флаконы по 100 мл и стерилизуют так же, как питательные среды.

Таблица 3

КОЛИЧЕСТВО ЕМКОСТЕЙ ДЛЯ КОНТРОЛЯ СТЕРИЛЬНОСТИ

В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ОБЩЕГО ЧИСЛА ЕМКОСТЕЙ В СЕРИИ И ОБЪЕМА

ПРЕПАРАТА В КАЖДОЙ ЕМКОСТИ

Кол-во емкостей в серии	Объем препарата в емкости
	0,5 мл									1 - 1,5 мл										2,0 мл и более
	Кол-во контролируемого препарата									Кол-во контролируемого препарата										Кол-во контролируемого препарата
	всего			пр-во			ОБК				всего			пр-во			ОБК				всего			пр-во			ОБК
	об- раз- цов	ем- кос- тей		об- раз- цов	ем- кос- тей		об- раз- цов	ем- кос- тей			об- раз- цов	ем- кос- тей		об- раз- цов	ем- кос- тей		об- раз- цов	ем- кос- тей			об- раз- цов	ем- кос- тей		об- раз- цов	ем- кос- тей		об- раз- цов	ем- кос- тей
501 - 1000		4	16		2	8		2	8			6	12		3	6		3	6			12	12		6	6		6	6
1001 - 2000		6	24		3	12		3	12			8	16		4	8		4	8			18	18		9	9		9	9
2001 - 3000		6	24		3	12		3	12			10	20		5	10		5	10			22	22		11	11		11	11
3001 - 4000		6	24		3	12		3	12			12	24		6	12		6	12			26	26		13	13		13	13
4001 - 5000		8	32		4	16		4	16			14	28		7	14		7	14			28	28		14	14		14	14
5001 - 6000		8	32		4	16		4	16			16	32		8	16		8	16			32	32		16	16		16	16
6001 - 7000		8	32		4	16		4	16			16	32		8	16		8	16			34	34		17	17		17	17
7001 - 8000		10	40		5	20		5	20			18	36		9	18		9	18			36	36		18	18		18	18
8001 - 9000		10	40		5	20		5	20			20	40		10	20		10	20			38	38		19	19		19	19
9001 - 10000 и более		10	40		5	20		5	20			20	40		10	20		10	20			40	40		20	20		20	20

Примечание. Расчет необходимого для контроля стерильности количества емкостей препарата в случаях иной расфасовки необходимо произвести по формуле, представленной в тексте инструкции.

7.7. Требования к качеству тиогликолевой среды

7.7.1. Готовая к употреблению тиогликолевая среда должна отвечать следующим требованиям:

7.7.1.1. Стерильность. Должна быть стерильной.

7.7.1.2. Ростовые свойства. Питательная среда должна обеспечивать рост аэробного и анаэробного тест-штаммов при посеве их в количестве менее 100 жизнеспособных клеток.

7.7.1.3. Нейтрализующие свойства. Питательная среда должна

-5

нейтрализовать действие мертиолята в концентрации 0,5 x 10 г/мл

среды.

При контроле препаратов, не содержащих ртутный консервант (мертиолят), проверку нейтрализующих свойств можно не осуществлять. В этом случае тиогликолевая среда должна быть использована в течение 2-х недель со дня приготовления.

Для препаратов с ртутным консервантом среду используют не позднее 3-х суток. Конкретные сроки годности - сутки, двое или трое суток - устанавливают при "входном" контроле новой серии среды путем определения ее нейтрализующих свойств после хранения приготовленной среды в течение одних, двух и трех суток.

Готовую к употреблению тиогликолевую среду следует хранить в защищенном от света месте при температуре 18 - 25 °С.

7.7.2. Контроль качества тиогликолевой среды

7.7.2.1. Определение стерильности. Пробирки или другие емкости со средой после ее стерилизации, в количестве не менее 2% от партии, помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) °С. Учет результатов проводят через 46 - 50 ч путем визуального просмотра всех пробирок со средой. В случае обнаружения пророста (помутнение среды) бракуют всю партию.

Образцы среды, выдержанные при температуре (37 +/- 1) °С, для испытания препаратов на стерильность не используют.

7.7.2.2. Определение ростовых свойств. Для определения ростовых свойств тиогликолевой среды используют следующие тест-штаммы:

- Alcaligenes faecalis 415;

- Clostridium novyi 198.

Alcaligenes faecalis 415. Получен из института Листера (г. Лондон) в 1946 г. Грамотрицательная палочка. Строгий аэроб. Непатогенен для человека и животных.

Clostridium novyi 198. Выделен в 1930 г. Крупная грамположительная спорообразующая палочка. Споры овальной формы, расположены субтерминально. Строгий анаэроб. Непатогенен для морских свинок и мышей.

Тест-штаммы получают из ГИСК им. Л.А. Тарасевича с соответствующим паспортом. Замена указанных тест-штаммов другими не допускается.

7.7.2.2.1. Хранение и подготовка тест-штаммов для контроля качества тиогликолевой среды.

Alcaligenes faecatis 415.

Вскрывают ампулу с лиофилизированной культурой, стерильной пастеровской пипеткой добавляют (приблизительно 0,5 мл) бульон Хоттингера (Приложение, п. 2), тщательно перемешивают до получения гомогенной суспензии и переносят в пробирку с бульоном Хоттингера и со скошенным агаром Хоттингера (Приложение, п. 3). Посевы инкубируют в течение 20 - 24 ч при температуре (37 +/- 1) °С.X

Выросшую на скошенном агаре Хоттингера культуру пересевают в 2 - 3 пробирки с той же средой (агар Хоттингера) <*>. Посевы инкубируют в течение 20 - 24 ч при температуре (37 +/- 1) °С, после чего полученную культуру "уколом" пересевают в 8 - 10 пробирок со средой Романова (Приложение, п. 4). Через 20 - 24 ч инкубации посевов при температуре (37 +/- 1) °С ватные пробки пробирок с культурой накрывают полиэтиленовой пленкой (для предотвращения высыхания). Пробирки с культурой хранят при температуре 2 - 8 °С (6 - 8 месяцев). Допускается, в случае необходимости (получение дополнительной партии пробирок с культурой, закладываемых на хранение), произвести пересев тест-штамма A.faecalis 415 со среды Романова на агар Хоттингера и вновь на среду Романова. Большее количество пассажей культуры не допускается.X

--------------------------------

<*> В случае отсутствия роста на агаре Хоттингера для последующего пассажа используют культуру, выращенную в бульоне.

Для получения рабочей культуры тест-штамм A.faecalis 415 со среды Романова пересевают в 2 - 3 пробирки со скошенным агаром Хоттингера. Посевы инкубируют в течение 20 - 24 ч при температуре (37 +/- 1) °С, затем вновь пересевают в 2 - 3 пробирки с агаром Хоттингера и, после выращивания в течение 18 - 24 ч при температуре (37 +/- 1) °С, используют для оценки ростовых и нейтрализующих свойств тиогликолевой среды.

Clostridium novyi 198.

Вскрывают ампулу с лиофилизированной культурой, стерильной пастеровской пипеткой добавляют (приблизительно 1 мл) предварительно регенерированную <*> среду Тароцци (Приложение, п. 5), тщательно перемешивают <**>. Полученную гомогенную суспензию переносят в 2 пробирки со средой Тароцци (посевной материал вносят в нижнюю часть пробирки). Посевы инкубируют в течение 44 - 48 ч при температуре (37 +/- 1) °С.X

--------------------------------

<*> Во всех случаях при посеве культуры C.novyi 198 на среду Тароцци пользуются регенерированной средой. Регенерацию среды осуществляют перед посевом путем выдерживания пробирок со средой в кипящей водяной бане в течение 10 - 15 мин. и последующего быстрого охлаждения в воде.

<**> Следует иметь в виду, что при работе с анаэробной культурой перемешивание осуществляют с помощью пипетки; при этом во избежание аэрации среды пипетку не вынимают из жидкости и содержимое из пипетки не выдувают до конца.

Культуру из обеих пробирок, соблюдая правила асептики, переносят во флакон, вместимостью 20 - 30 мл (кусочки мяса не должны попадать), и центрифугируют при частоте вращения 3000 об./мин. в течение 20 мин. Затем с помощью пипетки отсасывают надосадочную жидкость, а к полученной биомассе добавляют небольшое количество стерильного раствора для разведения культуры - разводящей жидкости (Приложение, п. 6), перемешивают, переносят в пробирку и готовят микробную взвесь, соответствующую 10-ти единицам по стандартному образцу мутности (ОСО 42-28-59-85).X

По 1 мл полученной взвеси высевают <*> в 10 - 15 пробирок с 10 мл предварительно регенерированной <**> питательной среды для получения культуры в споровой форме (Приложение, п. 7). Посевы инкубируют в течение 44 - 48 ч при температуре (37 +/- 1) °С, после чего содержимое пробирок перемешивают с помощью стерильной пипетки, делают мазки культуры (окрашивание производят 1%-ным раствором генцианвиолета в течение 30 с), микроскопируют и определяют количество спор (М) в процентах по формуле:X

--------------------------------

<*> Для определения чистоты культуры при всех пересевах тест-штамма C.novyi 198 следует производить высев на скошенный агар Хоттингера.

<**> Регенерацию среды для получения споровой культуры осуществляют аналогично регенерации среды Тароцци.

n

М = - x 100%,

N

где:

n - число спор в 3 - 5 полях зрения;

N - общее число (не менее 100) сосчитанных клеток (палочки и споры) в 3 - 5 полях зрения.

Пробирки с культурой, в которой не менее 5% спор, накрывают полиэтиленовой пленкой и хранят при температуре 2 - 8 °С.

В случае необходимости иметь большее количество пробирок с культурой, закладываемых на хранение (частый контроль), культуру в споровой форме следует пересеять на среду Тароцци (5 - 6 пробирок), инкубировать посевы при температуре (37 +/- 1) °С в течение 44 - 48 ч и далее получить споровую культуру по описанной выше методике.

Для получения рабочей культуры С.novyi 198 споровую культуру тест-штамма, хранящуюся в среде для получения спор, перемешивают с помощью пипетки и по 1 мл пересевают в 2 - 3 пробирки с 10 мл среды Тароцци. Содержимое одной пробирки со споровой культурой С.novyi 198 используют для 2 - 3-х посевов. Посевы инкубируют в течение 24 - 48 ч при температуре (37 +/- 1) °С до обнаружения отчетливо видимого роста культуры в виде диффузного помутнения среды с четко выраженной прозрачной зоной. После чего осуществляют повторный пересев тест-штамма в 2 - 3 пробирки со средой Тароцци. Через 17 - 19 ч инкубации при температуре (37 +/- 1) °С культуру используют для оценки ростовых свойств тиогликолевой среды.

При необходимости (срочный контроль тиогликолевой среды) культуру, выращенную в течение 24 - 48 ч после высева из ампулы, следует пересеять в 2 - 3 пробирки со средой Тароцци, инкубировать в течение 17 - 19 ч при температуре (37 +/- 1) °С и полученную культуру использовать для посева в тиогликолевую среду.

7.7.2.2.2. Посев тест-штаммов в тиогликолевую среду.

Alcaligenes faecalis 415.

Выросшую на скошенном агаре Хоттингера при температуре

(37 +/- 1) °С в течение 18 - 24 ч культуру тест-штамма A.faecalis

415 смывают с поверхности среды стерильным 0,9%-ным раствором

хлорида натрия, доводят концентрацию микробной взвеси до 10 единиц

по стандартному образцу мутности. Из данной взвеси культуры

десятикратным разведением (9 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия

-1

и 1 мл микробной взвеси) получают разведение 10 . Микробную

-1

взвесь из разведения 10 разводят стерильным 0,9%-ным раствором

хлорида натрия в соотношении 1:1 (4,5 мл 0,9%-ного раствора

-2

хлорида натрия и 4,5 мл микробной взвеси) - разведение 10

(условно). Полученную взвесь культуры десятикратными разведениями

-8

доводят до разведения 10 , меняя пипетку для каждого разведения.

Для контроля тиогликолевой среды используют разведения культуры

-6 -7 -8

тест-штамма A.faecalis 415 - 10 , 10 и 10 .

Из каждого указанного разведения по 0,1 мл микробной взвеси вносят в 3 пробирки с 10 мл тиогликолевой среды, погружая пипетку в середину столбика среды. Посев осуществляют, начиная с последнего разведения. Не позднее 48 ч инкубации при температуре 34 - 35 °С производят учет результатов.

Clostridium novyi 198.

Выросшую на среде Тароцци при температуре (37 +/- 1) °С в

течение 17 - 19 ч культуру тест-штамма С.novyi 198 центрифугируют

при частоте вращения 3000 об./мин. в течение 20 мин., удаляют

надосадочную жидкость. Полученную биомассу разводят стерильной

разводящей жидкостью до концентрации микробной взвеси,

соответствующей 10 единицам по стандартному образцу мутности. Из

данной взвеси культуры десятикратным разведением (9 мл разводящей

-1

жидкости и 1 мл микробной взвеси) получают разведение 10 .

-1

Микробную взвесь из разведения 10 разводят стерильной разводящей

жидкостью в соотношении 1:3 (6 мл разводящей жидкости и 2 мл

-2

микробной взвеси) - разведение 10 (условно). Полученную взвесь

-5

культуры десятикратными разведениями доводят до разведения 10 ,

меняя пипетку для каждого разведения <*>. Для контроля

тиогликолевой среды используют разведения культуры тест-штамма

-3 -4 -5

С.novyi 198 - 10 , 10 и 10 .

--------------------------------

<*> Не допускается выдерживание культуры в разводящей жидкости более 30 мин.

Из каждого указанного разведения по 0,1 мл микробной взвеси вносят в 3 пробирки с 10 мл тиогликолевой среды, погружая пипетку в середину столбика среды. Посев осуществляют, начиная с последнего разведения. Не позднее 48 ч инкубации при температуре 34 - 35 °С производят учет результатов.

7.8. Определение нейтрализующих свойств

Для определения нейтрализующих свойств тиогликолевой среды используют тест-штамм Alcaligenes faecalis 415, характеристика, хранение и подготовка которого для посева в тиогликолевую среду описаны выше (п. 2.2).X

Предварительно перед посевом культуры в каждую из 9-ти пробирок с 10 мл тиогликолевой среды пипеткой, вместимостью 2 мл, вносят по 0,5 мл 0,01%-ного раствора мертиолята <*>, погружая пипетку в середину столбика среды. Одной пипеткой вносят раствор мертиолята в 3 - 4 пробирки.

--------------------------------

<*> Приготовление 0,01 %-ного раствора мертиолята:

0,1 г мертиолята (импортного) растворяют в 100 мл стерильного 0,9%-ного раствора хлорида натрия. Полученный 0,1%-ный раствор мертиолята хранят во флаконе из темного стекла не более 3-х месяцев при температуре 2 - 8 °С. Перед посевом 0,1%-ный раствор мертиолята разводят в 10 раз стерильным 0,9%-ным раствором хлорида натрия (1 мл 0,1%-ного раствора мертиолята и 9 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия).

Во избежание аэрирования не следует содержимое из пипетки выдувать до конца.

По 0,1 мл микробной взвеси, тест-штамма A.faecalis 415 из

-6 -7 -8

разведений 10 , 10 и 10 , полученных, как указано ранее в п.

2.2, вносят в 3 пробирки (для каждого разведения) с тиогликолевой

средой, содержащей раствор мертиолята, погружая пипетку в середину

столбика среды. Не позднее 5-ти суток инкубации при температуре 34

- 35 °С производят учет результатов.

7.9. Учет результатов контроля

По окончании соответствующих сроков инкубации посевов осуществляют визуальный просмотр засеянных пробирок. Результаты контроля регистрируют в специальном журнале (Приложение, п. 8) и дают заключение о качестве тиогликолевой среды.X

Среду признают годной по ростовым свойствам, если не позднее

48 ч инкубации посевов визуально обнаруживается рост культуры не

менее чем в 2-х из 3-х засеянных пробирок при посеве тест-штамма

-7

A.faecalis 415 - из разведения 10 (около 40 жизнеспособных

клеток в посевной дозе), а тест-штамма С.novyi 198 - из

-4

разведения 10 (около 50-ти жизнеспособных клеток в посевной

дозе).

Допускается признать пригодной среду при следующих результатах

роста тест-штаммов:

A.faecalis 415 -

-6

при посеве из разведения: 10 - рост не менее чем в 2-х

пробирках;

-7

10 - рост не менее чем в 1

пробирке;

-8

10 - рост не менее чем в 1

пробирке.

С.novyi 198 -

-3

при посеве из разведения: 10 - рост не менее чем в 2-х

пробирках;

-4

10 - рост не менее чем в 1

пробирке;

-5

10 - рост не менее чем в 1

пробирке.

При росте тест-штамма A.faecalis 415 в тиогликолевой среде отмечается помутнение верхней части столбика среды.

При росте тест-штамма С.novyi 198 через 24 ч наблюдается образование отдельных шарообразных колоний, через 48 ч - диффузное помутнение среды с выраженной прозрачной зоной в верхней части столбика среды.

Тиогликолевую среду признают годной по нейтрализующим

свойствам, если не позднее 5 суток инкубации посевов визуально

обнаруживается, в случае предварительного введения в среду

мертиолята, выраженный рост тест-штамма A.faecalis 415 не менее

-7

чем в 2-х из 3-х засеянных пробирок при посеве из разведения 10 .

Допускается признать пригодной по нейтрализующим свойствам

среду при следующих результатах роста тест-штамма:

А.faecalis 415 -

-6

при посеве из разведения: 10 - рост не менее чем в 2-х

пробирках;

-7

10 - рост не менее чем в 1

пробирке;

-8

10 - рост не менее чем в 1

пробирке.

Описание характера роста тест-штамма A.faecalis 415 изложено выше.

Тиогликолевая среда, не отвечающая по нейтрализующим свойствам необходимым требованиям (при полном соответствии качества среды по всем другим показателям), может быть использована для контроля стерильности препаратов, не содержащих ртутный консервант.

Приложение

1. Тиогликолевая среда

Состав:

1. Гидролизат казеина неглубокой степени

расщепления ферментативный сухой - 15,0 г

2. Экстракт кормовых дрожжей для

микробиологических питательных сред сухой (ЭКД) - 5,0 г

3. Натрия хлорид - 2,5 г

4. Глюкоза - 5,0 г

5. L-цистин - 0,75 г

6. Кислота тиогликолевая или - 0,3 мл

натрия тиогликолят - 0,5 г

7. Агар микробиологический - 0,75 г

8. Вода дистиллированная - 1000 мл.

pH 7,0 +/- 0,2 (после стерилизации среды)

Приготовление

В дистиллированную воду вносят гидролизат казеина, экстракт дрожжей, хлорид натрия, агар, размешивают и нагревают до температуры 60 - 70 °С. Цистин предварительно растворяют при постепенном добавлении 10%-ного раствора гидроксида натрия (до полного растворения). Раствор цистина вносят в приготовленную смесь, устанавливают pH 8,0 - 8,2 с помощью 10%-ного раствора гидроксида натрия, кипятят в течение 2 - 3 мин. до полного расплавления агара. Добавляют глюкозу и тиогликолевую кислоту, фильтруют через фильтровальную бумагу, устанавливают pH 7,2 - 7,3 с помощью 5%-ного раствора соляной кислоты. Среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин. Готовую среду хранят в защищенном от света месте при температуре 18 - 25 °С.

2. Бульон Хоттингера

Состав: г/л

1. Гидролизат Хоттингера - 20,0

2. Натрия хлорид - 5,0.

Приготовление

Гидролизат Хоттингера <*> смешивают с дистиллированной водой из расчета содержания в 1 л среды 20 г сухих веществ, вносят такое количество хлорида натрия, чтобы содержание его в среде составляло 5 г/л.

--------------------------------

<*> Во всех питательных средах, имеющих в своем составе гидролизат Хоттингера, используется гидролизат, предварительно освобожденный от балластных белков, которые удаляют путем подкисления до pH 4,5 - 4,7 с помощью раствора соляной кислоты (соотношение с водой 1:1), последующего кипячения в течение 1 - 2 минут и фильтрации через ватно-марлевый фильтр.

Устанавливают pH 8,0 - 8,2 с помощью 10%-ного раствора гидроксида натрия, кипятят в течение 2 - 3 мин., фильтруют через фильтровальную бумагу, устанавливают pH 7,2 - 7,4 с помощью 5%-ного раствора соляной кислоты. Разливают по 10 мл в стерильные пробирки и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин.

Готовая среда годна к употреблению в течение 2-х месяцев со дня приготовления при условии хранения ее при температуре 2 - 8 °С.

3. Агар Хоттингера

Состав: г/л

1. Гидролизат Хоттингера - 20,0

2. Натрия хлорид - 5,0

3. Агар микробиологический - 13,0 - 20,0 <*>.

--------------------------------

<*> Варьирование величины связано с различной прочностью студня агара.

Приготовление

Гидролизат Хоттингера (Приложение, п. 2) смешивают с дистиллированной водой из расчета содержания в 1 л среды 20 г сухих веществ, вносят такое количество хлорида натрия, чтобы содержание его в среде составляло 5 г/л и агар.X

Устанавливают pH 8,0 - 8,2 с помощью 10%-ного раствора гидроксида натрия. Расплавление агара производят в автоклаве при температуре 100 °С в течение 1 ч, затем среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают pH 7,2 - 7,4 с помощью 5%-ного раствора соляной кислоты. Разливают по 5 мл в стерильные пробирки и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин.

Готовая среда годна к употреблению в течение 2-х месяцев со дня приготовления при условии хранения ее при температуре 2 - 8 °С.

4. Среда Романова

Состав: г/л

1. Гидролизат казеина панкреатический - 8,0

2. Натрия хлорид - 5,0

3. Агар микробиологический - 5,0 - 10,0 <*>.

--------------------------------

<*> Варьирование величины связано с различной прочностью студня агара.

Приготовление

Панкреатический гидролизат казеина <*> смешивают с дистиллированной водой из расчета содержания в 1 л среды 8,0 сухих веществ, вносят такое количество хлорида натрия, чтобы содержание его в среде составляло 5 г/л, и агар, устанавливают pH 8,0 - 8,2 с помощью 10%-ного раствора гидроксида натрия. Расплавление агара производят в автоклаве при температуре 100 °С в течение 1 ч, затем среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают pH 7,2 - 7,4 с помощью 5%-ного раствора соляной кислоты. Разливают по 5 мл в стерильные пробирки и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин.

--------------------------------

<*> Используют панкреатический гидролизат казеина с содержанием общего азота 12,0 - 12,5% и аминного азота 5 - 7%, предварительно освобожденный от балластных белков по методу, изложенному для гидролизата Хоттингера (Приложение, п. 2).X

Готовая среда годна к употреблению в течение 2-х месяцев со дня приготовления при условии хранения ее при температуре 2 - 8 °С.

5. Среда Тароцци

Состав: г/л

1. Гидролизат Хоттингера - 25,0

2. Глюкоза - 5,0

3. Натрия хлорид - 5,0

4. Агар микробиологический - 1,0

5. Фарш мясной (на 1 пробирку с 10 мл среды) - 0,3 - 0,5.

Приготовление

Гидролизат Хоттингера (Приложение, п. 2) смешивают с дистиллированной водой из расчета содержания в 1 л среды 25,0 г сухих веществ, вносят такое количество хлорида натрия, чтобы содержание его в среде составляло 5 г/л, и агар, устанавливают pH 8,0 - 8,2 с помощью 1%-ного раствора гидроксида натрия. Смесь кипятят до расплавления агара в течение 2 - 3 мин., фильтруют через ватно-марлевый фильтр, добавляют глюкозу и устанавливают pH 7,4 - 7,6 с помощью 5%-ного раствора соляной кислоты. Разливают по 10 мл в пробирки, содержащие мясной фарш, и стерилизуют автоклавированием при температуре 110 °С в течение 30 мин.X

Готовая среда годна к употреблению в течение месяца со дня приготовления при условии хранения ее при температуре 2 - 8 °С.

Приготовление фарша

Мясной фарш заливают питьевой водой в соотношении 1:5 (по объему) и кипятят в течение 1 - 2 мин., затем сливают воду, фарш промывают водой и отжимают. Фарш заливают дистиллированной водой и повторяют операцию, используя дистиллированную воду, до получения полностью обезжиренного фарша. (В случае использования сырого фарша его предварительно кипятят в воде в течение 30 мин.) Отжатый с помощью ручного пресса и подсушенный на фильтровальной бумаге фарш закладывают в стерильные флаконы, стерилизуют автоклавированием при температуре 120 °С в течение 30 мин. и хранят при температуре 18 - 25 °С.

По мере необходимости фарш раскладывают по стерильным пробиркам (из расчета 0,3 - 0,5 г на 10 мл среды), стерилизуют автоклавированием при температуре 120 °С в течение 30 мин. и выдерживают при температуре 37 - 45 °С до полного высыхания фарша.

Следует иметь в виду, что при использовании недостаточно обезжиренного и высушенного фарша в среде может наблюдаться опалесценция.

6. Раствор для разведения культуры ("разводящая" жидкость)

Состав (на 1 л раствора):

1. Натрия хлорид - 8,5 г

2. Кислота тиогликолевая - 0,3 мл.

Приготовление

Растворяют 8,5 г хлорида натрия в 1 л дистиллированной воды, добавляют 0,3 мл тиогликолевой кислоты, устанавливают pH 7,2 +/- 0,2 с помощью 10%-ного раствора фосфата натрия двузамещенного, разливают во флаконы и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин.

Разводящую жидкость можно использовать в течение недели со дня приготовления при соблюдении следующего условия: если срок хранения раствора превышает сутки со дня приготовления, его необходимо регенерировать перед посевом путем выдерживания флаконов в кипящей водяной бане в течение 10 - 15 мин. и последующего быстрого охлаждения в воде.

Для удобства работы разводящую жидкость перед регенерацией рекомендуется, соблюдая правила асептики, разлить по 9 мл в стерильные пробирки, регенерировать ее в пробирках и затем использовать для разведения культуры.

7. Среда для получения спор

Состав: г/л

1. Гидролизат казеина неглубокой степени

расщепления ферментативный сухой - 15,0

2. Глюкоза - 2,0

3. Натрия хлорид - 5,0

4. Агар микробиологический - 1,0

5. Казеин хлоркальциевый (на 1 пробирку с

10 мл среды) 0,3 - 0,5.

Приготовление

Гидролизат казеина смешивают с дистиллированной водой, вносят хлорид натрия и агар. Устанавливают pH 7,9 - 8,1 с помощью 10%-ного раствора гидроксида натрия. Смесь кипятят до расплавления агара в течение 2 - 3 мин., фильтруют через ватно-марлевый фильтр, добавляют глюкозу. Разливают по 10 мл в пробирки, содержащие стерильный казеин <*>, и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин.

--------------------------------

<*> Стерилизацию казеина осуществляют в пробирках автоклавированием при температуре 120 °С в течение 30 мин.

Готовая среда годна к употреблению в течение 2-х мес. со дня приготовления при условии хранения ее при температуре 2 - 8 °С.

Таблица 4

ЖУРНАЛ

УЧЕТА РЕЗУЛЬТАТОВ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА ТИОГЛИКОЛЕВОЙ СРЕДЫ

┌─┬────────┬───────┬────────┬───────────────────────────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────────────┬─────┬─────┬────┐

│N│ Дата │N │Дата │ Ростовые свойства │ Нейтрализующие свойства │Зак- │Под- │При-│

│ │контроля│серии │приго- ├─────────────────────────────┬─────────────────────────────┼────────────────────────────────────────────┤люче-│пись │ме- │

│п│ │среды, │товления│ A.faecalis 415 │ С.novyi 198 │ A.faecalis 415 │ние │отв. │ча- │

│/│ │конт- │среды ├──────────────┬──────────────┼──────────────┬──────────────┼──────────────┬──────────────┬──────────────┤о │за │ние │

│п│ │рольный│ │ 24 ч │ 48 ч │ 24 ч │ 48 ч │ 24 ч │ 48 ч │ 5 сут. │при- │конт-│ │

│ │ │номер │ ├──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┼──────────────┴──────────────┴──────────────┤год- │роль │ │

│ │ │ │ │ Разведение │ Разведение │ности│ │ │

│ │ │ │ ├──────────────┬──────────────┬──────────────┬──────────────┼──────────────┬──────────────┬──────────────┤среды│ │ │

│ │ │ │ │ -6 -7 -8│ -6 -7 -8│ -3 -4 -5│ -3 -4 -5│ -6 -7 -8│ -6 -7 -8│ -6 -7 -8│ │ │ │

│ │ │ │ │10 10 10 │10 10 10 │10 10 10 │10 10 10 │10 10 10 │10 10 10 │10 10 10 │ │ │ │

├─┴────────┴───────┴────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴─────┴─────┴────┤

│ Пример │

├─┬────────┬───────┬────────┬──────────────┬──────────────┬──────────────┬──────────────┬──────────────┬──────────────┬──────────────┬─────┬─────┬────┤

│1│21.09.94│07 │20.09.94│ + + + │ + + + │ + + + │ + + + │ - - - │ + + - │ + + + │При- │ │ │

│ │ │к/N 123│ │ + + + │ + + + │ + + - │ + + + │ - - - │ + + - │ + + + │год- │ │ │

│ │ │ │ │ + + - │ + + + │ + + - │ + + - │ - - - │ + - - │ + + - │на │ │ │

└─┴────────┴───────┴────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴─────┴─────┴────┘

8. Испытание на токсичность

Настоящему испытанию подлежат препараты, предназначенные для внутривенного, внутримышечного и подкожного введения. Методы испытания на токсичность препаратов, вводимых человеку другими способами, излагают в частных фармакопейных статьях.

Испытание проводят на двух видах животных: белых мышах обоего пола, массой 18 - 20 г, и морских свинках обоего пола, массой 250 - 350 г. В исследованиях должны быть использованы здоровые животные, содержащиеся в соответствии с действующими правилами, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. Массу животных определяют в день начала испытания.

8.1. Испытание на белых мышах. Препарат вводят внутрибрюшинно 5-ти животным в дозе, равной одной максимальной разовой дозе для человека, но не более 1 мл, если в частной фармакопейной статье нет указаний на другую дозировку. Сухой препарат растворяют соответствующим растворителем, который вносят в объеме, указанном на этикетке. Если препарат предназначен для внутривенного введения, то его токсичность определяют при внутривенном введении, при этом испытуемая доза не должна превышать 0,5 мл, а скорость введения 0,1 мл/сек. Препарат, вводимый внутривенно, должен иметь температуру (36 +/- 1) °С.

8.2. Испытание на морских свинках. Препарат вводят подкожно 2 животным в дозе, равной одной максимальной разовой дозе для человека, но не более 10 мл, если в частной фармакопейной статье нет указаний на другую дозировку. Сухой препарат растворяют соответствующим растворителем, который вносят в объеме, указанном на этикетке. Если препарат предназначен для внутривенного введения, то его токсичность определяют при внутрибрюшинном введении, при этом испытуемая доза не должна превышать 5 мл.

Препараты вводят стерильным шприцем, погрешность измерения которого не должна превышать 4%. Для введения объемов до 1 мл включительно используют шприцы, вместимостью 1 мл; свыше 1 мл - шприцы, вместимостью 2 или 5 мл. Наблюдение за животными осуществляют ежедневно в течение 7 сут.

Препарат считают выдержавшим испытание, если:

- в течение периода наблюдения все животные остались живы и ни у одного из них не были выявлены видимые признаки заболевания;

- масса каждого животного в день окончания наблюдения не уменьшилась по сравнению с исходной;

- ни у одной морской свинки, получившей препарат подкожно, не развился некроз или абсцесс в месте введения (возможность развития других проявлений реакции в месте введения препарата указывают в частной фармакопейной статье).

Если в течение периода наблюдения регистрируют гибель, заболевание, уменьшение массы, развитие некроза или абсцесса в месте введения хотя бы у одного животного, испытание должно быть повторено на удвоенном количестве животных того же вида. Повторное испытание считают удовлетворительным, если препарат отвечает вышеперечисленным требованиям.