Глава 2. Объект и методы исследования

2.1 Объект и предмет исследования

В качестве объекта исследования была выбраны сельскохозяйственные культуры: горох ((Pisum sativum L.), сорта Чишминская-99) , кукуруза ((Zea mays L.), сорта РИК-340).

Предметом исследования служила арбускулярная микориза растений и влияние засухи.

2.2. Методы исследования

2.2.1. Методика посадки семян

Для посадки были отобраны крупные ровные семена (по 3 г. семян пшеницы). После отбора и предварительной обработки бактериями производили посев семян в почву. Для эксперимента использована черноземная почва (верхний гумусовый слой) Стерлитамакского района. Поливали почву дистиллированной водой, и накрывали полиэтиленом до наклевывания. На 3-й день, когда семена наклюнулись, убирали пленку. Выращивали в течение 60 дней.

2.2.2. Обработка семян бактериями Bacillus subtilis

Обработку семян бактериями проводили в стерильных условиях (в ламинар-боксе). Готовый препарат бактерий B. subtilis 26Д 109 кл/мл разводили в растворе KCl (0,01%) до концентрации 106 кл/мл. Семена обрабатывали раствором бацилл из расчета на 1г семян 20 мкл клеток бактерий, выдерживались в течение часа, затем производили посадку семян в почву.

Штаммы B.subtilis 26Д (ВНИИСХМ №128) и 11ВМ (ВНИИСХМ №519) предоставлены сотрудниками Башкирского государственного аграрного университета г. Уфа. Разведением в стерильном 0,9%-ном растворе NaCl получали культуры с такой концентрацией, чтобы в сосудах с водорослями число клеток бацилл составляло 10⁶ в 1 см³ .

2.2.3. Условия произрастания растений в условиях засухи

Почвенную засуху имитировали следующим способом. После посева семян почву во всех сосудах поливали дистиллированной водой до влажности 70% от полной полевой влагоемкости, которую определяли расчетным методом [ГОСТ Р 53764-2009 (ИСО 11461:2001). Качество почвы. Определение содержания почвенной влаги в виде объемной доли с применением трубок для отбора пробы грунта. Гравиметрический метод, 2010].

После появления всходов контрольными растениями служили те, которые поливались из расчета создания 70% влажности почвы. Опытные растения (имитация засухи) выращивались в сосудах, в которых влажность почвы поддерживалась на расчетном уровне 30%. Полив проводили через каждые три дня (или по мере начала визуального завядания листьев). Растения выращивали на светоплощадке с фотопериодом 16 ч, при температуре воздуха 22-25оС.

2.2.4. Методика сбора образцов

Через 60 дней извлекали растения из земли аккуратно, не повреждая корней и листьев, промывали в проточной воде. На весах определяли массу побегов. Корни отмывали, окрашивали и анализировали на наличие микоризы.

2.2.5. Методика окрашивания корней

Окрашивание корней производилось по следующему методу [Trouvelot, Kough, Gianinazzi-Pearson, 1986, с. 217-221]:

1. Отбирали корни 10-20 шт. с одного образца.

2. Промывали под проточной водой (при помощи сита), помещали в марлевые мешочки.

3. Раствор 10% КОН доводили до кипения, выключали плитку, помещали марлевые мешочки с образцами в этот раствор на 10 мин. Покоричневение раствора свидетельствовало о процессе очистки.

4. Промывали водой 4-5 раз.

5. Большинство гистологических красителей являются кислыми, поэтому подкисляли корни 2% НСl в течение 15-20 мин.

6. Готовили краситель трепановый синий и добавляли в приготовленный раствор (вода, глицерин, молочная кислота в соотношении 1:1:1 по объему). Нагревали его до кипения, выключали плитку, помещали образцы на 3-4 мин.

7. Промыли 4-5 раз водой. Краситель используется несколько раз.

8. Образцы хранили при температуре 4°С в воде.