Гетерогенний іфа
Антитіла Ат зв'язуються із|із| стінками лунки на планшеті полістиролу (мал. 3, а). Надлишок Ат змивають буферним розчином. Ділянки скріплення|зв'язування| на поверхні полістиролу, що залишилися незайнятими|заклопотаний|, блокують додаванням|добавкою| стороннього білка, наприклад бичачим сироватковим альбуміном|; поверхню знов|знову,щойно| відмивають (на мал. 3, а не показано). Зразок|взірець|, що містить|утримувати| антиген Аг в невідомій концентрації, змішують з|із| певною кількістю міченого антигена і додають|добавляти| до антитіл, фіксованих на підкладці полістиролу. Аг і АГ—Е| конкурентно зв'язуються з|із| Ат. Поверхню полістиролу знову відмивають для видалення|віддалення| незв'язаних Аг і АГ—Е|. Після|потім| цього визначають активність ферменту в лунці планшета полістиролу, яка буде обернено пропорційна концентрації антигена в досліджуваному зразку|взірець|. Це конкурентний гетерогенний ІФА|.
На мал. 3, був показаний| інший варіант гетерогенного ІФА| — неконкурентний, так званий метод сендвічу. На поверхні полістиролу сорбували антитіла Ат1, зв'язуючі Аг (він повинен володіти не менше чим двома валентностями) з|із| тестованого зразка|взірець|. Потім додають|добавляти| другі антитіла Ат2, зшиті з|із| ферментом Е. Після видалення|віддалення| надлишку Ат2—Е в лунку планшета полістиролу додають|добавляти| субстрат реакції і визначають активність ферменту, яка лінійно залежатиме від концентрації Аг в зразку|взірець|.
Мал. 3. Конкурентний (а) і неконкурентний (б) гетерогенний Імуноферментний| аналіз
За допомогою спеціального спектрального приладу результати ферментативної| реакції в планшетах полістиролів можна зміряти|виміряти| за одну хвилину в 96 лунках. Проте|однак| в цілому|загалом| гетерогенний ІФА| триваліший| гомогенного. Його проведення вимагає до 3—4 годин, оскільки на кожному етапі операції повинна встановитися рівновага, і лише після|потім| цього можна провести відмивання імунносорбенту|, яка теж|також| займає|позичати,посідати| час.
6. Застосування|вживання| іфа
Чутливість ІФА| така, що визначення речовин в концентраціях 10 9—10 12 М, білка в мікрограмах-| нанограмах в 1 мл| — це буденна справа|річ|. Подібно до того, як око людини реєструє одиночний світловий квант, ІФА| можна удосконалити так, що він за допомогою каскадних систем посилення дозволить виявляти одиночні молекули аналізованої речовини.
Можливості|спроможність| збільшення чутливості обмежуються фоном аналізованого з'єднання|сполучення,сполука| (тобто|цебто| його наявністю не тільки|не лише| в аналізованому зразку|взірець|, але і у використовуваних реактивах і розчинниках), субстратною| специфічністю ферменту і аффінністю| антитіл. До обмежень ІФА| відноситься також наявність в тестованих зразках|взірець| кофакторів|, інгібіторів і стимуляторів активності ферментів. Ще один недолік|нестача| — ІФА| не дозволяє розрізняти активні| білки і їх біологічно неактивні фрагменти, що зберегли антигенні детермінанти. Перешкодою для ІФА| може бути зміна каталітичної активності ферменту при його кон’югірованні| з|із| антигеном. Обмеженням ІФА| є|з'являтися,являтися| його застосовність лише до добре вивчених систем, де є очищені|обчищений| антигени і високоспецифічні антитіла.
Висока чутливість у поєднанні з швидкістю|прудкість| аналізу (від декількох хвилин до декількох годин), можливістю|спроможність| одночасного тестування великої кількості зразків|взірець| і відсутністю особливої необхідності попередніх операцій по очищенню і концентрації аналізованого з'єднання|сполучення,сполука| в зразку|взірець| додають|наділяти,надавати| ІФА| незаперечні|безперечний| переваги перед іншими аналітичними методами. Тому сьогодні ІФА| знаходить|находити| широке застосування|вживання| в охороні здоров'я, різних областях сільського господарства, промисловій біотехнології, природоохоронній діяльності і науково-дослідній роботі.
Будь-яке захворювання людини і тварин можна швидко і точно діагнозувати| шляхом ідентифікації збудника, його окремих антигенних компонентів|, антитіл до цих компонентів або речовин, не властивих здоровому організму і що синтезуються при його патологічних станах (рак, серцево-судинні і ендокринні захворювання). Диспансеризація населення, епідеміологічні обстеження, виявлення отруєнь, наявність наркотиків в крові, визначення змісту|вміст,утримання| лікарських з'єднань|сполучення,сполука| в тканинах, вірусні захворювання рослин, визначення антибіотиків, вітамінів і інших біологічно активних з'єднань|сполучення,сполука| при відборі активних штамів в промисловій біотехнології, контроль за якістю медичних препаратів з|із| донорської крові на відсутність вірусів-збудників Сніду і гепатиту B — це лише невеликий перелік практичного застосування|вживання| ІФА|. Сучасні фундаментальні дослідження в біохімії, клітинній|клітковий| фізіології і імунології, мікробіології, вірусології, онкології важко уявити без ІФА|.
ЛІТЕРАТУРА
Абелев Г.И. Основи імунітету // Соросівський Освітній Журнал|часопис|. 1996. № 5. З|із|. 4—10.
Галактионов В.Г. Як працює імунна система // Там же. 1997. №12. З|із|. 2-9.
Абелев Г.И. Моноклональні антитіла // Там же. 1998. № 1.С. 16-20.
Березин И.В. і ін. Біотехнологія / Ред. Н.С. Егоров, В.Д. Самуїлов. М.: Вища. шк|., 1987. Кн. 8: Інженерна энзимологія|.
Егоров А.М. і ін. Теорія і практика іммуноферментного| аналізу. М.: Вища. шк|., 1991.
Іммуноферментний аналіз / Ред. Т.Т. Нго, Р. Ленхофф. М.: Мир|світ|, 1988.