2. Матеріали і методи досліджень

2. 1. Об'єкт дослідження

Об'єкт дослідження – головний мозок білих щурів лінії Вістар. Предмет дослідження – cтан мієліну, розподіл основного білка мієліну (ОБМ) та загального протеїну в різних відділах головного мозку щурів на початкових етапах постнатального розвитку та за умов ішемічного ураження.

У першій частині досліджень визначали концентрацію ОБМ та загального протеїну (ЗП) у мозку білих щурів лінії Вістар. Досліджували показники білка у мозку 1-денних, 1-місячних та 3-місячних щурів. З цією метою використовували мозок 18 щурів, розподілених на три групи: 1 – одноденні особини (n=6, маса тварин 4–6 г), 2 – одномісячні (n=6, маса тварин 45–60 г) і 3 – тримісячні тварини (n=6, маса тварин 50–100 г).

Друга частина досліджень присвячена визначенню вмісту ЗП та ОБМ в різних відділах мозку за умов глобальної ішемії.

2. Ізадрин-пітуїтринова модель ішемії

Використано мозок 24 шестимісячних щурів вагою 150–190 г. Щурів розподілено на 4 групи (n = 6): 1 група – контрольна (контроль) – тварини утримувалися за стандартною дієтою, вводили фізіологічний розчин (0,9%-й розчин натрій хлориду); 2 група – ішемія (ішемічна група) – вводили пітуїтрин двічі на добу з розрахунку 100 мг/кг маси (внутрішньочеревинно, 0,2 мл на 1 тварину) + ізадрин – тричі на добу з розрахунку 0,5 ОД/кг маси тіла (підшкірно, 0,4 мл на 1 тварину); 3 група – лікували Корвітином (Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод, Україна) протягом 5 діб (по 0,42 мл на 1 тварину: 1 день – три введення: 1-ше і 2-ге – з інтервалом 2 год, 2-ге і 3-тє – з інтервалом 12 год; 2-3 дні – по два введення з інтервалом 12 год; 4-5 дні – 1 введення); 4 група – після завершення ін'єкцій ізадрину та пітуїтрину тварин лікували α-Кетоглутаратом (1%-й розчин) протягом 6 днів (перорально). Тварин 2 групи виводили з експерименту після завершення введення ізадрину та пітуїтрину; тварин 3 та 4 груп – після завершення введення відповідних терапевтичних препаратів. Всі дослідження проведені згідно з «Положенням про використання тварин у біомедичних дослідах» [56].

2. 3. Отримання білкових фракцій з мозку піддослідних тварин

Тварин декапітували під слабким наркозом (ізофлуран). Із мозку виділяли три відділи: кору великих півкуль, таламус та гіпокамп, які у подальшому використовували для отримання цитозольної та мембранної фракції білків за допомогою диференційного центрифугування гомогенату.

Отримання білкових фракцій з мозку щурів проводилось методом диференціального центрифугування гомогенату тканини мозку в гіпотонічному буфері за схемою (рис. 2. 1).

Г омогенізація мозку ( на 100 мг мозку 1 мл буфера А)

водорозчинні білки центрифугування, 50 000g, 60 хв.

S₁

мембранні білки ресуспендування в буфері А, що містить 2%-й тритон Х-100, інкубація 12 годин;

центрифугування 100 000g, 60 хв

S₂

Рис. 2. 1. Загальна схема диференціального центрифугування [57]

Вихідний буфер містив трис-гідроксиметиламінометан гідрохлорид (трис-HCl) – 0,25 мМ (рН 7,4), етилендіамінтетраоцет (ЕДТО) – 1 мМ, дитіотрейтол – 2 мМ, фенілметилсульфонілфторид (ФМСФ) – 0,2 мМ, азид натрію (NaN₃) – 3 мМ (вказані реагенти були придбані у Sigma, США). Мембранні білки екстрагували за допомогою тритон Х-100 – 2% у вихідному буфері [57].