1.1. Белки, пептиды и аминокислоты

Поступающие с пищей белки в организме человека выполня­ют важнейшие функции, многие из которых незаменимы. Извест­но, что белковое голодание в течение нескольких дней приводит к серьезным заболеваниям, а длительное отсутствие в пище бел­ков вызывает смерть человека. Белки содержатся *во всех продук­тах питания, но массовая доля их весьма различна. Например, в мясе — 18—22 мае. %, рыбе — 17—20, яйце — 20—36, молоке — 3,5, ржаном хлебе — 7,8 мае. %.

Важность информации о количественном содержании белков связана с определением потенциальных возможностей продуктов питания в покрытии физиологических потребностей организма человека, норма которых составляет около 100 г белка в сутки.

Белки сами по себе не являются незаменимыми компонента­ми пищи человека. Для нормального питания и поддержания здоровья необходимы содержащиеся в них незаменимые амино­кислоты, обязательность наличия которых в пищевых рационах связана с тем, что они не синтезируются животными организ­мами. В связи с этим весьма важно их качественное и коли­чественное соотношение. Белки, содержащие все незаменимые аминокислоты, называют полноценными. Если в белке нет хотя бы одной незаменимой аминокислоты, то он считается неполно­ценным. Постоянная нехватка полноценного белка в пище ведет к возникновению анемии, отечности тканей, развитию дегене­ративных изменений почек, печени и поджелудочной железы,

9

нарушению умственных способностей, вызывает тяжелые не­обратимые нарушения физиологических функций.

Большинство белков мяса относится к полноценным, что дела­ет их обязательным компонентом пищи.

Количественное содержание и физико-химические свойства бел­ков определяют поведение пищевых систем под воздействием воды, электролитов, рН среды, окислителей и восстановителей, нагрева­ния и т. д., что имеет весьма важное значение в формировании задан­ных функционально-технологических и органолептических свойств сырья, полуфабрикатов и готовых мясных продуктов, включая фор­мирование коагуляционно-денатурационной структуры фаршевых изделий, сваривание и гидротермический распад коллагена при до­ведении продуктов до кулинарной готовности.

Уникальные биологические функции и технологическое значе­ние белков в производстве мясных продуктов тесно связаны с осо­бенностями их химического строения и пространственной струк­туры, отличающихся разнообразием, динамичностью и наличием внутримолекулярных взаимодействий, способностью изменяться под воздействием внешних факторов в водно-солевых растворах и водных растворах полярных растворителей, восстанавливать ис­ходное состояние, вступать в различные реакции, включая биока­талитические процессы.

В состав мяса и мясопродуктов входят простые и сложные белки, в том числе водо-, соле- и щелочерастворимые, обеспечи­вающие, например, такие важные функции, как удержание воды, набухаемость и растворимость, а также сложные белки-пигмен­ты, отвечающие за цвет продукта. Белки различаются не только химическим и пространственным строением, но и размерами частиц, а также формой молекул. Последняя включает две груп­пы — фибриллярные и глобулярные, отличающиеся физико-хи­мическими свойствами, прежде всего растворимостью в воде, водно-солевых растворах и водных растворах полярных раство­рителей, а также способностью к денатурации, гидролизу и дру­гим превращениям.

Белки мяса и мясопродуктов принято разделять по морфологи­ческому признаку клеток мышечных тканей животных (рис. 1.1). Саркоплазматические, миофибриллярные белки и белки стромы обеспечивают функциональность пищевой системы в получении мясопродуктов, а группа ядерных белков самостоятельного техно­логического значения не имеет.

Фракция суммарных белков саркоплазмы составляет 20—25 % количества всех мышечных белков. Установлено, что белки сар­коплазмы способны образовывать гель, особенно в присутствии АТФ. При высоких концентрациях Са²⁺ гель разжижается. Это связано с присутствием в саркоплазме фрагментов саркоплазмати- ческого ретикулума. Очищенные от примесей белки саркоплазмы способность желировать утрачивают.

10

Рис. 1.1. Белки клетки мышечной ткани животных

Миоген представляет собой комплекс миогенов А, В и С, раз­личающихся кристаллической формой. Обычно под миогеном подразумевается вся миогеновая фракция. Миоген составляет около 20 % всех белков мышечного волокна. Он растворяется в воде, образуя гомогенные растворы небольшой вязкости с мас­совой долей 20—30 %. Температура денатурации свободного от солей миогена 55—60 °С, изоэлектрическая точка (ИЭТ) лежит в интервале рН 6,0—6,5. С течением времени часть миогена пере­ходит в нерастворимое состояние.

Миоальбумины составляют около 1—2% белков мышечного волокна. Растворимы в воде и нерастворимы в кислой среде, так как имеют изоэлектрическую точку около рН 3,0—3,5; темпе­ратура денатурации 45—47 °С.

Глобулин ^составляет около 20 % общего количества белковых веществ мышечного волокна. Растворим в солевых растворах даже очень низкой концентрации, температура денатурации при рН 6,5 около 50 °С, при рН 7,0 — около 80 "С, изоэлектрическая точка ле­жит в интервале рН 5,0—5,2.

Миоглобин — хромопротеид, составляющий в среднем 0,6—1,0 % общего количества белков. Он состоит из белковой части — глоби­на и простетической группы — гема. На одну молекулу миогло- бина приходится одна группа гема. В миоглобине не обнаружено цистина. Миоглобин хорошо растворим в воде. Температура де­натурации около 60 "С. Денатурация миоглобина сопровождается отщеплением простетической группы. Миоглобин способен при­соединять оксид азота, сероводород и кислород за счет дополни­тельных связей. В последнем случае образуется оксимиоглобин светло-красного цвета, который переходит с течением времени в метмиоглобин коричневого цвета. При этом железо отдает один

11

Миоглобин (п у р пу р н о - кра с 11 ы й)

+0,

Оксимиоглобмн

(светло-красный) 2 +

Fe

Восстановление

Окисление

Метмиоглобин (коричневый)

Fe ~

Рис. 1.2. Взаимопревращения пигментов мяса

электрон. При действии восстановителей метмиоглобин снова об­разует миоглобин. Последний окрашен в пурпурно-красный цвет и обусловливает естественную окраску мышечной ткани, интен­сивность которой зависит от его содержания и соотношения форм пигментов белка. Изменение цветности мяса и мясопродуктов (рис. 1.2) происходит под влиянием микрофлоры, теплового воз­действия, посола, света и других факторов. Количество пигмен­тов, глубина их превращений и образование форм соответствую­щей окраски играют значительную роль в получении продуктов высокого качества. При переходе миоглобина в метмиоглобин пурпурно-красная окраска мяса меняется на коричневую. Она наиболее заметна, когда в мет-форму переходит более 50 % мио­глобина. Это свойство широко используется для определения сроков хранения мяса путем выявления соотношения различных спектральных форм миоглобина, а также при регулировании цвет­ности мясопродуктов.

Миозин — фибриллярный белок с асимметрией молекулы 10:1, составляет около 40 % белков клетки мышечной ткани. Гетеро- генен. Обычно под миозином подразумевается вся миозиновая фрацция. Миозин — полноценный, хорошо переваримый белок. Совершенно чистый миозин растворим в воде и образует вяз­кий раствор с массовой долей до 4 % белка. Растворы солей щелочных металлов небольшой молярной концентрации (0,25— 0,04 моль/дм³) осаждают миозин из его растворов; в солевых растворах повышенной молярной концентрации (до 0,6 моль/дм³) он растворяется. Температура денатурации миозина около 45— 50 °С (у птицы около 51 °С); изоэлектрическая точка определяется при рН 5,4. Биологические функции миозина связаны с коорди­нированным движением живых организмов и автолитическими превращениями мышечных тканей после убоя животных.

Актин составляет 12—15% всех мышечных белков и является основным компонентом тонких нитей. Этот белок существует в двух формах — глобулярной (Г-форма) и фибриллярной (Ф-фор- ма). В растворах с низкой ионной силой актин существует в виде мономера с относительной молекулярной массой около 47 000.

12

1 1 рИ повышении пинпи/1 ^KUIDI aw ч^имилш п

уровня Г-актин полимеризуется в Ф-актин, очень похожий на нить. Г-актин представляет собой одну полипептидную цепочку, сложенную в глобулу. Быстрая полимеризация актина происходит также при добавлении ионов Mg²". При этом образуется двунит- чатая спираль, каждая составляющая в которой напоминает нить бус, закрученных одна вокруг другой. Актин относится к полно­ценным и легкоусвояемым белкам.

Актомиозин — это сложный комплекс, который формируется при добавлении раствора актина к раствору миозина и со­провождается увеличением вязкости раствора. Поскольку цепь Ф-актина содержит много молекул Г-актина, каждая нить Ф-ак- тина может связывать большое число молекул миозина. Рост прекращается при добавлении АТФ или в присутствии ионов Mg²⁺. Содержание актомиозина указывает на глубину автолити- ческих превращений в процессе трупного окоченения и позволя­ет опосредованно судить о функциональности мясного сырья в процессе технологической обработки.

Тропомиозин — белок палочковидной формы с относительной мо­лекулярной массой около 70 ООО, постоянно присутствующий в структуре тонких (актиновых) филаментов. Биологическая роль тро- помиозина сводится к регулированию взаимодействия актина и мио­зина в процессе мышечного сокращения. Массовая доля тропомио- зина составляет 10—12 % всех белков миофибрилл или 2,5 % белков мышц. Растворим в воде, но из мышечной ткани водой не извлекает­ся. Изоэлектрическая точка определяется при рН 5,1.

Тропонин представляет собой сферическую молекулу с относи­тельной молекулярной массой 76 000, включающей три субъеди­ницы, аминокислотный состав которых полноценен.

Весьма важной группой сложных белков являются нуклеопро- теиды, играющие первостепенную роль в жизнедеятельности организма, в частности в явлениях наследственности. Простети­ческой группой нуклеопротеидов служат нуклеиновые кислоты. Они нерастворимы в воде, но растворяются в щелочах. В их состав входит простой белок, как правило протамин или гистон. При полном гидролизе нуклеопротеидов образуются а-аминокислоты, рибоза и дезоксирибоза, фосфорная кислота и азотистые основа­ния (пуриновые и пиримидиновые). Массовая доля нуклеопроте­идов в мышечной ткани составляет 0,207—0,245 %, где они входят в состав рибосом и саркоплазматического ретикулума. В основном это рибонуклеопротеиды, функции которых связаны с синтезом белков. Нуклеопротеидами богаты ткани мозга, где они представ­лены нейроглобулином (дезоксирибонуклеопротеидом) и нейро- стромином (рибонуклеопротеидом). Нуклеопротеиды являются полноценными белками, однако, как отмечалось выше, самостоя­тельного технологического значения не имеют и входят в состав мышечных клеток.

13

В состав перечисленных белков входят все аминокислоты, включая важнейшую из них — триптофан, что послужило осно­вой для оценки количественного содержания полноценных бел­ков в сырье и продуктах.

Из белков стромы важная роль отводится коллагену, эласти­ну и ретикулину, по наличию которых судят о прочностных свойствах соединительных тканей. Это протеиноиды, являю­щиеся фибриллярными белками упроченной структуры, нераст­воримые в обычных растворителях.

Уникальными свойствами обладает коллаген. Фибриллы кол- лагеновых нитей состоят из субъединиц, называемых тропоколла- геном, в котором /^-группы всех аминокислот находятся на внеш­ней стороне молекулы и мало участвуют в стабилизации структу­ры. Характерным признаком коллагена является высокое содер­жание пролина и нестандартной аминокислоты — гидрокси- пролина (рис. 1.3, а), сумма которых составляет около 21 %. На определении 4-гидроксипролина (оксипролина) основаны мно­гие методы количественного анализа коллагена. Нестандартная аминокислота — гидроксилизин (рис. 1.3, б) также может служить средством идентификации коллагенов.

Коллаген способен сильно набухать в водных растворах, при этом масса его увеличивается в 1,5—2 раза. По этому свойству он уступает лишь миозину мышечной ткани. Высокая гидрата­ция коллагена связана с содержанием в его структуре значи­тельных количеств диамино- и аминодикарбоновых кислот. При смещении рН в кислую или щелочную сторону от ИЭТ на- бухаемость коллагена резко увеличивается, при этом масса бел­ка в состоянии полного набухания может достигнуть от 400 до 1000 % к массе сухого белка. Способность коллагена к набуха­нию имеет большое значение для мясного, желатинового и ко­жевенного производств.

Вторым важным белком стромы мышечных волокон и со­единительных тканей является эластин. Это, по существу, мно­гокомпонентная система, представленная сложными белками —

он

не, сн-,

Н,С³ CH-

он

XH-COOH HiN—СН->—СН—СН->—СН-,—СН—COON

6

4

ОН

Н о

6

Рис. 1.3. Структурные формулы нестандартных аминокислот, входя­щих в состав коллагена:

а — гидроксипролин; б — гидроксилизин

14

гликопротеинами. Подобно КОЛЛаГеНу ЭЛЭСТИН UUlcii 1лицпт/ш аланином. Тропоэластин отличается от тропоколлагена большим содержанием лизина, но малым — пролина. Суммарное содержа­ние глицина, аланина, валина и пролина в эластине составляет почти 70 %. Из-за малого содержания кислых и основных амино­кислот молекула эластина практически неполярна. В водной среде цепи эластина принимают форму глобул. Гидрофобные цепи ами­нокислот, образующие соответствующие связи, спрятаны внутри молекулы, окруженной водой. В результате свободная энергия си­стемы минимальна. Точная структура эластина, к сожалению, пока не идентифицирована. В то же время установлено, что он очень устойчив: не растворяется в холодной и горячей воде, соле­вых растворах, разбавленных растворах кислот и щелочей. Даже концентрированная серная кислота оказывает на него слабое воз­действие. Он не образует желатин, практически не расщепляется пищеварительными ферментами.

Ретикулин также входит в состав стромы мышечных волокон и соединительных тканей. Подобно коллагену и эластину он являет­ся гликопротеином, неполярен, очень устойчив, плохо усваивает­ся организмом.

Таким образом, группа соединительнотканных белков имеет общие свойства и структурные признаки. Именно они использу­ются в исследовательской практике для оценки пищевой ценнос­ти сырья и продуктов путем их количественного анализа, напри­мер, при определении сорт^ мяса, а также пищевой ценности по соотношению триптофана и оксипролина.

В соответствии с современной теорией питания роль соедини­тельнотканных белков пересмотрена. Установлено положительное влияние ингредиентов соединительной ткани на процесс пищева­рения. Показано, что коллаген и эластин обладают свойствами пищевого волокна, проявляют радиопротекторные свойства, ак­тивно стимулируют секреторную и двигательную функции желуд­ка и кишечника, оказывают благоприятное действие на состояние и функцию полезной кишечной микрофлоры. На основе коллаге­на и других белков соединительной ткани создаются биологичес­ки ценные пищевые продукты и добавки с лечебно-профилакти­ческим эффектом. Для рационального использования сырьевых ресурсов и создания биологически полноценных продуктов, обес­печивающих здоровье человека, весьма важно дозированное вве­дение соединительных тканей в рецептурные композиции, что возможно лишь на основе количественного анализа соответствую­щих ингредиентов.

Гистидинсодержащие дипептиды являются специфической со­ставной частью скелетной мускулатуры. Из мышечной ткани жи­вотных и человека они были выделены в начале века русским био­химиком В. С. Гулевичем. Установлено, что эти вещества выпол­няют ряд важных функций в процессе обмена веществ и энергии

15

при жизни, участвуя в процессах окислительного фосфорилирова- ния, происходящих в мышцах при образовании макроэргических фосфатных соединений (АТФ и креатинфосфата). Входя в состав мышечной ткани, гистидинсодержащие дипептиды стимулируют секреторную функцию пищеварительных желез. К ним относятся: карнозин — дипептид, состоящий из остатков (3-аланина и гисти- дина, и ансерин — гомолог карнозина, (З-аланил-1-метилгистидин (метилированный карнозин).

, 1 Chb-CH-COOH / i—сьь-сн-соон

I \ "I / \ - I

N. NH NH N N-СНз NH

| |

CO-(CH₂)₂-NH₂ CO-(CH₂)₂-NH₂

Карнозин Ансерин

В скелетных мышцах убойных животных содержание карнози­на и ансерина колеблется в пределах 0,014—1,000 %.

Кровь — жидкая соединительная ткань животного организ­ма, которая циркулирует в артериях, венах и капиллярах. Пред­ставляет собой непрозрачную жидкость красного цвета со сла­бощелочными свойствами (рН 7,3—7,5), специфического запаха и солоноватого вкуса. На долю крови приходится в среднем у крупного рогатого скота 7,5 % живой массы, у свиней — 4,5, у овец — 7 и у птицы — 8 %. Кровь вместе с лимфой и тканевой жидкостью, окружающей клетки, является внутренней средой организма, которая объединяет органы с тканями и выполняет ряд весьма важных прижизненных функций (доставка молеку­лярного кислорода и питательных веществ к клеткам организ­ма, освобождение тканей от углекислоты и продуктов распада). Дыхательная, питательная, выделительная, защитная, регуля- торная функции крови обеспечиваются определенными ее ком­понентами, а в целом кровь представляет собой сложную мно­гокомпонентную систему. После убоя животных кровь частич­но остается в капиллярах и потому является неотъемлемой составляющей мяса. В настоящее время кровь приобретает ог­ромное значение и как самостоятельное сырье для производства антианемических продуктов, фракции крови используются для структурирования пищевых систем, придания окраски продук­там, получения эмульсий, обогащения продуктов органическим железом, которое в 4—6 раз быстрее усваивается организмом по сравнению с другими источниками. В связи с вышеизложенным анализ веществ и компоентов крови необходим для расширения спектра максимального и рационального использования этого важного сырья.

16

Кровь состоит из жидкой части — плазмы и взвешенных в ней форменных элементов. К форменным элементам относятся: эри­троциты (красные кровяные тельца), лейкоциты (белые кровяные тельца), тромбоциты (кровяные пластинки, бляшки). В крови раз­ных видов животных массовая доля форменных элементов неоди­накова: в среднем у крупного рогатого скота 33 %, у мелкого — 28, у свиней — 43,6 % к массе крови.

Кровь, лишенная форменных элементов (например, центри­фугированием с соблюдением мер предосторожности против свертывания), представляет собой плазму. На долю растворимых веществ плазмы крови приходится 9—10 % ее массы, из них око­ло 7 % составляют белки, остальная часть состоит из липидных компонентов, азотистых и безазотистых экстрактивных и мине­ральных веществ.

Плазма крови, из которой выделен белок фибриноген (пред­шественник фибрина), называется сывороткой.

Белки крови как пищевое сырье эффективнее, чем другие белки, могут восстанавливать белки плазмы и гемоглобин в организме. В связи с этим среди пищевых белков одно из пер­вых мест принадлежит именно им. Массовая доля белков в цельной крови зависит от вида, возраста, упитанности, условий предубойного содержания животных и в среднем составляет: у крупного рогатого скота 17,41 %, баранов — 16,59, свиней — 2,25 %. При этом в среднем 6,8—7,3 % белков находится в плаз­ме, 30,3—32,7 % — в форменных элементах. Основная масса бел­ков крови представлена альбуминами, глобулинами, фибрино­геном и гемоглобином.

По аминокислотному составу наиболее полноценным является фибриноген, в структуре которого содержится 3,5 % триптофана, 7,0 % фенилаланина, 2,6 % метионина.

Фибриноген — основной компонент системы свертывания крови. Он нерастворим в воде, но хорошо растворим в раз­бавленных растворах нейтральных солей и щелочах, осаждает­ся сульфатом магния и хлоридом натрия ранее, чем насту­пает полное насыщение. Таким образом, фибриноген близок по своим свойствам к глобулинам. Фибриноген быстро усва­ивается.

Сывороточные альбумин и глобулин также содержат пол­ный набор незаменимых аминокислот, хотя и в меньшем ко­личестве. Особенно мало содержание триптофана в сывороточ­ном альбумине. Гемоглобин нельзя отнести к полноценным белкам, так как в нем отсутствует изолейцин. Однако содержа­ние других незаменимых аминокислот в нем довольно высокое. Поэтому в сочетании с другими белками крови его можно рас­сматривать как важнейший источник жизненно необходимых аминокислот.

17

хаким ооразом, пищевая и биологическая ценность крови тесно связана с наличием при­родного пигмента — гемоглоби­на. Это сложный белок, состоя­щий из окрашенной простети­ческой группы гема (рис. 1.4) и бесцветной белковой части — глобина. Молекула гемоглоби­на по своей форме приближает­ся к сфере диаметром около 5,5 нм, относительная молеку­лярная масса 64 500, ИЭТ при рН 5,5. Гемоглобин в кислой и щелочной средах диссоци­ирует на гем и глобин. Так, если добавить раствор гемогло­бина к смеси ацетон — НС1, то глобин осаждается, а гем оста­ется в растворе. Особенно полезна информация о количестве гемоглобина как источника органического железа, усвояемость которого прямо пропорциональна содержанию гемовых пигментов (табл. 1.1).

Таблица 1.1 Формы железа и его усвояемость для различных видов мяса

Мясо и мясопродукты	Массовая доля железа, %		Коэффициент усвояемости железа, %
	гемового	негемового
Говядина	20,2	79,8	18
Свинина	15,3	84,7	16
Баранина	18,3	81,7	17
Птица	18,3	81,7	17
Печень	28,0	72,0	14
Кровь	69,3	30,7	31

Концентрация гемоглобина в крови зависит от вида животного и количества эритроцитов. Гемоглобин разных животных разнит­ся аминокислотной последовательностью. Гемоглобин выполняет функцию дыхательного белка — переносчика кислорода. При воз­действии на гемоглобин окислителей железо гема переходит в трехвалентную форму и образует подобно миоглобину метгемо- глобин. Изменение валентности связано с изменением цвета про­дукта от ярко-алого до коричневого, что имеет прямое технологи­ческое значение. Некоторые фракции белков плазмы крови обла­дают желирующими свойствами. Сывороточный альбумин спосо­

Рис. 1.4. Схема гема

18

бен желировать плазму, ^тот факт открыьае1 нившь u^wivMnu_U, использования крови для пищевых целей, особенно при получе­нии структурированных продуктов, и ставит перед технологами задачу отработки и внедрения методов исследования компонен­тов крови.

Использование крови и ее фракций для пищевых целей, в том числе для создания нетрадиционных лечебно-профилактических и специальных продуктов, актуально для решения задач рацио­нального использования ресурсов, организации безотходных тех­нологий на мясокомбинатах, улучшения экологических условий производства.

В аналитической практике известно достаточно много методов определения белков. Наиболее распространены метод Кьельдаля и его известные модификации, основанные на минерализации проб и количественном определении азота.

Получившие в последнее время распространение ускоренные фотометрические методы (рис. 1.5) имеют существенные преиму­щества по сравнению с классическим методом Кьельдаля. Основ­ные из них — простота и быстрота выполнения — позволяют ис­пользовать эти методы для массовых анализов и проведения опе­ративного контроля качества сырья и готовой продукции по со­держанию белка.

Эти методы весьма перспективны, особенно для однород­ных систем, и основаны на непосредственном фотометрирова- нии пробы.

Метод Лоури основан на реакции взаимодействия фенольно- го реактива Фолина—Чокалтеу с щелочными растворами белков, приводящей к образованию продуктов реакции синего цвета. Ин­тенсивность окраски зависит от содержания в исследуемом белке тирозина и триптофана. Оптическую плотность окрашенных раст­воров измеряют при длине волны 750 нм. Метод рекомендуется для определения массовой доли белка в сильно разбавленных растворах, при наблюдении за ходом ферментативных процессов, для определения белков сыворотки крови, яичного альбумина, белков молока, фракционированных растительных белков, белков митохондриальных фракций и мембран.

Рис. 1.5. Экспресс-методы определения белков в мясе и мясных продуктах

19

. . - Д 1 CI KJ \J yajuuc1нии сине-фиолетовой

окраски при воздействии на белки сульфата меди в присутствии щелочи. Природа белка почти не влияет на формирование ок­рашенного биуретового комплекса, который возникает за счет присоединения ионов меди к пептидным связям белка. Опти­ческую плотность окрашенных растворов измеряют при длине волны около 540 нм. Преимущества метода — возможность при­менения стандартного белка, например сывороточного альбу­мина, для построения калибровочного графика, воспроизводи­мость и точность.

Методы определения массовой доли белка по связыванию кра­сителей основаны на способности белков при рН ниже изоэлект- рической точки (рН 2—4) присоединять кислые красители с обра­зованием нерастворимых комплексов, после удаления которых из­меряют оптическую плотность исходного раствора красителя от­носительно полученного раствора (фильтрата):

Белок + Краситель Белок-краситель (осадок) + + Краситель (раствор несвязавшегося красителя).

Оптическая плотность фильтрата уменьшается с увеличением массовой доли белка. Методы рекомендуются для количественно­го определения белка в образцах сырого мяса, а также в продуктах кулинарной степени готовности после различных видов техноло­гической обработки (варки, запекания, копчения и т. д.).

Методы УФ-спектроскопии основаны на способности белко­вых растворов поглощать свет при длине волны около 280 нм бла­годаря присутствию в структуре белков аминокислот триптофана, тирозина и фенилаланина. Результаты определения прямо про­порциональны содержанию этих аминокислот в белках. Преиму­щества метода — малая трудоемкость, несложная подготовка проб, быстрота и простота анализа; предел чувствительности 10— 20 мкг/см³. Методы рекомендуются для количественной оцен­ки содержания белков в элюатах после разделения белковых сме­сей методом электрофореза или хроматографии, определения бел­ков в мясных, яичных и бобовых продуктах.

К высокоточным методам относятся хроматографические.

Хроматография — метод разделения смесей газов, жидкостей, растворенных веществ путем сорбции в динамических условиях. В простейшем варианте разделение происходит при прохождении потока анализируемой смеси через колонку, содержащую сорбент. Вследствие различной сорбируемости компонентов смеси дости­гается их разделение по высоте сорбента при повторяющихся циклах сорбция — десорбция.

Известно несколько подходов к классификации методов хро­матографии с использованием различных признаков:

20

по средам, в которых проводится разделение (жидкостная, га­зожидкостная, газовая);

по механизму разделения (молекулярная или адсорбционная, ионообменная, осадочная, комплексообразовательная, окислитель­но-восстановительная) ;

по форме проведения процесса (колоночная, капиллярная, хроматография на бумаге и в тонком слое);

по способу проведения процесса (фронтальная, вытеснитель- ная, проявительная).

В табл. 1.2 хроматографические методы систематизированы по подвижным и неподвижным фазам, форме проведения процесса и принципу разделения.

Таблица 1.2

Классификация методов хроматографии по принципу разделения

Методы хроматографии

Подвижная фаза (ПФ)

Неподвиж­ная фаза (НФ)

Форма неподвиж­ного слоя

Принцип разде­ления

Жидкостная:

твердо-жидкостная

жидкостно-жидкост-

ная

ионообменная

Газовая:

газоадсорбционная газожидкостная

Гель-хроматография

Хроматография в тон­ком слое

Хроматография на бу­маге

Аффинная

Жидкость Твердая » Жидкость

» Твердая

Колонка

Газ

>>

Жидкость

Твердая Жидкость

Лиганд

Адсорбционный Распределитель­ный

Ионный обмен

Адсорбционный Распределитель­ный

По размерам мо­лекул

Адсорбционный

Распределитель­ный

Тонкий слой

Хрома- то графи­ческая бумага

Колонка Адсорбционный

По области применения хроматографические методы де­лятся:

на аналитические (установление качественного и количествен­ного составов смесей);

неаналитические (исследование физико-химических характе­ристик сорбатов — давления пара, теплоты растворения, коэф­фициентов активности);

21

.ipviitl^U l ПОП diu ^пилучсние веществ в чистом и особо чис­том виде);

промышленные (получение индивидуальных веществ, напри­мер лекарственных препаратов, в больших количествах).

Каждый хроматографический метод по мере развития сопро­вождался возникновением новых вариантов. Например, адсорб­ционная и распределительная хроматография осуществляется на колонках (колонки могут иметь различную форму и конструк­цию), фильтровальной бумаге и в тонком слое сорбента, нанесен­ном на стеклянную пластинку. В зависимости от этих факторов различают следующие варианты: колоночная, хроматография на бумаге, хроматография в тонком слое.

Жидкостная хроматография (ЖХ) — метод разделения и анализа сложных смесей, в котором подвижной фазой является жидкость. Метод ЖХ характеризуется более широким кругом анализируемых объектов, чем газовая хроматография, поскольку большинство ве­ществ не обладает достаточной летучестью, многие неустойчивы при высоких температурах (особенно высокомолекулярные соеди­нения) и разлагаются при переходе в газообразное состояние. В ме­тоде ЖХ разделение проводят, как правило, при комнатной темпе­ратуре. Особенности различных вариантов ЖХ обусловлены физи­ко-химическими свойствами жидкой подвижной фазы.

Газовая хроматография (ГХ) — метод разделения и определения летучих соединений. Компоненты анализируемой смеси распре­деляются между неподвижной фазой (твердое вещество или жид­кость) и газом-носителем (подвижная фаза).

Твердая неподвижная фаза применяется в газоадсорбцион­ной хроматографии (TAX). Разделение обусловлено адсорбци­онными свойствами наполнителя колонки по отношению к раз­деляемым соединениям, преимущественно газам. Распростра­ненные адсорбенты — силикагель, активированный уголь, мо­лекулярные сита и цеолиты.

Жидкая неподвижная фаза применяется в газожидкостной хро­матографии (ГЖХ). Она распределяется в виде тонкой пленки на поверхности инертного твердого носителя. Большой выбор жид­ких фаз, позволяющий работать в широком температурном диа­пазоне (20—400°С), делает ГЖХ наиболее селективным хрома- тографическим методом разделения не только жидких, но и не­которых твердых соединений. Низкие пределы обнаружения, экс- прессность, точность и простота операций обеспечили методу ГЖХ широкое применение для анализа сложных объектов.

Гель-хроматография — метод разделения веществ, основанный на различии размеров их молекул. Метод известен под названия­ми «гель-проникающая», «эксклюзионная» и «молекулярно-сито- вая хроматография». Последнее название наиболее полно отража­ет сущность метода, однако более распространен термин «гель- проникающая хроматография».

22

В качестве неподвижной фазы применяют гели, имеющие опре­деленный размер пор; подвижной фазы — водные или органичес­кие элюенты. Наиболее простое объяснение механизма разделения в гель-хроматографии состоит в том, что молекулы анализируемых веществ распределены между неподвижным растворителем в порах сорбента и элюентом, протекающим через слой неподвижной фазы. Молекулы с размером, позволяющим проникать в поры сор­бента при движении вдоль колонки, задерживаются в порах. Моле­кулы, имеющие размеры большие, чем поры, не проникают в сор­бент и вымываются из колонки со скоростью движения элюента. Молекулы, проникающие в поры всех размеров, движутся наиболее медленно. Снижение скорости движения компонентов вдоль ко­лонки прямо связано с количеством пор, в которые способны диф­фундировать распределяемые частицы.

Таким образом, методом гель-хроматографии можно разделять смеси веществ в зависимости от размеров их молекул. Выход компонентов из колонки происходит в порядке снижения их молекулярных масс. Вытекающие из колонки растворы анали­зируют различными методами, например спектрофотометричес- ким, фотометрическим, титриметрическим.

Наиболее широкое распространение среди носителей для гель-хроматографии белков получили сорбенты, приготовленные на основе декстрана (сефадексы, сефакрилы, молселекты), поли- акриламида (биогели Р, акрилексы), агарозы (сефарозы, био­гели А) и др. Набухая в воде, они образуют гели.

Номер в маркировке сефадекса означает его пористость. Вы­бор определенной марки сефадекса определяется молекулярной массой исследуемого белка (чем больше соответствие размеров молекул и величины пор, тем выше селективность), а степень зернения зависит от поставленной задачи. Для обессоливания растворов белков и их концентрирования обычно используют се­фадексы G-25 и G-50 (грубый или средний). При разделении же смеси белков пользуются сефадексами тонкого или сверхтонкого зернения. Чем мельче частицы геля, тем эффективнее происхо­дит разделение, но тем меньше скорость протекания раствора че­рез колонку.

Гели готовят путем насыщения водой или элюентом в течение 5—20 ч соответствующего гелеобразователя (сефадекс, полиакрил- амид и др.). Продолжительность и температура насыщения указа­ны на упаковке препарата.

Ионообменная хроматография основана на динамическом сте- хиометрическом обмене ионов между анализируемым раствором и ионообменником (ионитом). Этот метод широко применяется при анализе, разделении и очистке органических и неорганичес­ких соединений, ионизирующих в водных и неводных раствори­телях. Объем удерживания зависит от изменения свободной энергии реакции ионного обмена. Соотношение концентраций

23

ооменивающихся ионов в растворе и в фазе сорбента определяет­ся ионообменным равновесием.

При фракционировании белков методом ионообменной хро­матографии большое внимание уделяют выбору ионообменника (природе материала и емкости ионита) и буферного раствора (величине рН и ионной силы, природе буфера и буферной емкос­ти), при котором осуществляется сорбция веществ.

При работе с белками в качестве сорбентов используют иони- ты, обладающие высокой степенью гидрофильности.

Белки могут быть разделены как на катионитах, так и на анионитах. Выбор типа ионита определяется изоэлектрическими точками хроматографируемого материала и устойчивостью белка в определенной зоне значений рН.

Эффективная сорбция белков происходит при значениях рН, отстоящих от р! не менее чем на единицу. В области рН < pi — ] белки можно исследовать на катионитах, а в области рН > pi + 1 — на анионитах. Изменение рН в направлении к ИЭТ способству­ет десорбции белков. При работе с белками используют буфер­ные растворы с низкой ионной силой, но высокой буферной емкостью. Для этого пользуются буферными растворами, рК которых отстоит от величины рН, используемой в экспери­менте, не более чем на 0,3—0,5 единицы рН. Хроматографию на анионитах ведут в таких системах, где диссоциируемым компонентом является катион (буферы: трис, пиридин, имида- зол и др.), а для катионитов — анион (ацетатный, фосфатный, бикарбонатный буфер и др.).

При ионообменной хроматографии смесь белков сорбируется в верхней части колонки и затем вытесняется веществами, умень­шающими их сорбцию на ионите. Понижение сорбции осущест­вляют повышением ионной силы раствора и (или) изменением его рН. Изменение рН и ионной силы элюирующего буферного раствора можно проводить путем создания ступенчатого или гра­диентного элюирования.

Разделение аминокислот методом ионообменной хроматогра­фии проводят обычно на синтетических смолах — катионитах, представляющих собой сополимеры стирола с дивинилбензо- лом. Роль ионогенных группировок в них играют сульфогруппы (—S0₃H). Такие смолы являются сильными электролитами и диссоциируют при любых значениях рН на SO^-ионы, прочно связанные со смолой, и противоионы Н⁺, переходящие в раст­вор. Во избежание закисления буферных растворов, окружаю­щих смолу, ионы Н⁺ в ней замещают на ионы Na⁺, т. е. исполь­зуют смолу в форме S0₃Na. Для того чтобы осуществить сорб­цию аминокислот на смоле путем обмена с ионами Na, их пере­водят в форму Na-катионитов. С этой целью аминокислоты помещают обычно в Na-цитратный буферный раствор при рН 2,2.

24

При этом значении рН все аминокислоты несут положитель­ный заряд и находятся в виде катионов

NH*

соон

Степень прочности сорбции и десорбция на смоле разных аминокислот, определяемая главным образом величинами заря­дов молекул, различна. Наиболее прочно на смоле сорбируются диаминокислоты и наименее прочно — дикарбоновые аминокис­лоты. Разделение аминокислот при ионообменной хроматогра­фии происходит при десорбции их со смолы элюирующими бу­ферными растворами, отличающимися от исходного буферного раствора большими величинами рН и (или) ионной силы. Обыч­но для элюирования кислых и нейтральных аминокислот ис­пользуют Na-цитратные буферные растворы с рН 3,25 и 4,25. Для десорбции со смолы наиболее прочно связанных (основных) ами­нокислот используют более щелочной Na-цитратный буферный раствор со значением рН 5,28 и более высокой ионной силой (0,35 моль/дм³).

Разделение аминокислот на колонках в настоящее время про­водят автоматически в специальных приборах, называемых анали­заторами аминокислот. Погрешность определения на этих прибо­рах для многих аминокислот достигает 0,1 %. Для работы на этих анализаторах требуется 0,3—1 мг белка.

Метод широко используется при определении состава свобод­ных аминокислот и связанных в структуре белков и пептидов.

Хроматография в тонком слое (ХТС) — один из простейших ме­тодов хроматографического анализа, разделение компонентов при котором происходит при перемещении подвижной фазы через нанесенный на подложку (пластинку) тонкий слой сорбента. Про­движение элюента (подвижная фаза) по сорбенту (неподвижная фаза) обеспечивается капиллярными силами.

Хроматография в тонком слое основана на принципах распре­делительной и адсорбционной хроматографии.

В качестве носителей при тонкослойной хроматографии ча­ще всего используют измельченный силикагель или порошок целлюлозы, а также оксид алюминия, кизельгур, крахмал, сефа- декс и др. В последнее время широкое распространение полу­чил метод разделения аминокислот на пластинках, покрытых ионообменной смолой. В качестве растворителей используют системы с органическими растворителями различной степени полярности. Тонкослойная хроматография имеет ряд преиму­ществ по сравнению с хроматографией на бумаге: она характе­ризуется быстротой разделения (30—60 мин в зависимости от размеров пластинки), большей чувствительностью метода (при­

25

мерно в Ш раз) и устойчивостью слоя сорбента по отношению к агрессивным проявителям и нагреванию.

Хроматографию на пластинках проводят в закрытых стеклянных камерах, предварительно насыщенных парами растворителя, восхо­дящим способом, при комнатной температуре или при нагревании, одномерным или двухмерным способом. Последний (второй раст­воритель движется по пластинке в направлении, перпендикуляр­ном к первому) используют для повышения эффективности метода. Часто тонкослойную хроматографию сочетают с электрофорезом (метод пептидных карт). В этих случаях пробу наносят в виде не­большого пятнышка (d~2—Змм) в один из углов пластинки на расстоянии 20 мм от ее краев. При одномерном хроматографирова- нии пробы наносят на пластинку в виде полос.

Многие коммерческие сорбенты для тонкослойной хромато­графии содержат флуоресцентные красители, что позволяет идентифицировать разделяемые соединения, поглощающие элек­тромагнитные волны в ультрафиолетовой области спектра.

В настоящее время разделение аминокислот (гидролизатов белков) методом тонкослойной хроматографии осуществляют на пластинках, покрытых тонким слоем ионообменной смолы полистирольной природы с сульфокислотными группировка­ми (типа Дауэкс 50 х 8) или ионообменной целлюлозой. Такие пластинки выпускаются промышленностью, например «Фикси- он 50x8» (Венгрия), или могут быть приготовлены непосред­ственно в лаборатории.

Сочетание процессов ионообменной и тонкослойной хрома­тографии при разделении на пластинках «Фиксион 50 х 8» обус­ловливает высокую разрешающую способность этого метода.

Пластинки могут быть использованы для разделения амино­кислот, олигопептидов, аминов и др.

Метод хроматографического разделения на бумаге основан на различной растворимости разделяемых веществ в двух мало сме­шивающихся жидкостях, одна из которых удерживается бумагой, а другая подвижна. Неподвижной фазой служат полосы фильтро­вальной бумаги, которые, будучи помещенными во влажную ка­меру, удерживают до 20—22 % влаги, оставаясь внешне сухими. В качестве подвижной фазы обычно используют органический растворитель, насыщенный влагой. Чем больше растворимость аминокислот или пептидов в неподвижной фазе, тем медленнее они движутся при продвижении органического растворителя по бумаге и наоборот. Скорость движения будет определяться коэф­фициентом распределения, характерным для вещества в данной системе растворителей:

где с с_п(Ь — соответственно концентрация в неподвижной и подвижной фазе.

26

Следовательно, относительное расположение анализируемых веществ на хроматограмме для данной системы растворителей постоянно и характеризуется величиной коэффициента ско­рости движения.

_п ^раств

^Rf-"с—' (1.2)

где S _ств — расстояние, пройденное растворенным соединением; 5_фр — расстоя­ние, пройденное фронтом растворителя.

Тем не менее следует учитывать, что воспроизводимость зна­чения Лу-зависит от качества бумаги, постоянства температуры, степени чистоты растворителей, однотипности процедур и аппа­ратуры и т. д.

При разделении аминокислот и пептидов обычно пользуют­ся трехкомпонентными системами: к насыщенному влагой орга­ническому растворителю добавляют кислоты, основания, неко­торые спирты, кетоны и др. Это приводит, во-первых, к повы­шению растворимости воды в подвижной фазе (увеличению гидрофильности системы), во-вторых, к изменению диссоциа­ции кислых и основных групп разделяемых соединений. Вслед­ствие этого кислоты замедляют движение оснований, а основа­ния — кислот.

На практике для разделения аминокислот и пептидов основно­го характера используют системы, содержащие фенол и крезол, для нейтральных — смеси с бутиловым спиртом и уксусной кис­лотой или с амиловым спиртом, а для кислых аминокислот и пептидов — системы, содержащие соединения основного характе­ра (обычно пиридин). Если соединение плохо растворимо в под­вижной фазе и остается на стартовой линии, следует увеличить гидрофильность системы, например, добавив муравьиную кисло­ту, метанол или формамид. Если же вещество хорошо раствори­мо в подвижной фазе и движется вместе с фронтом растворите­ля, следует использовать органический растворитель с более вы­раженными гидрофобными свойствами, например изоамиловый, бензиновый спирты и др.

Для лучшего разделения соединений с близкими значениями Rf> а также для увеличения величин Rj часто проводят хромато- графирование в нескольких (обычно двух) системах растворите­лей, пропуская второй растворитель в том же направлении, что и первый. Это приводит к уплотнению пятен разделяемых соедине­ний в направлении, перпендикулярном к пропускаемому раство­рителю, и способствует их лучшему разделению. Более полного разделения аминокислот и пептидов можно добиться при двух­мерной хроматографии (второй растворитель пропускают в на­правлении, перпендикулярном к первому) или при сочетании хро-

27

монографии (одно направление) и электрофореза (второе взаимно перпендикулярное направление). Последний метод носит назва­ние метода «пептидных карт» или «отпечатка пальцев».

При повторном разделении в системах растворителей положе­ние пятна на хроматограмме устанавливают путем определения значений коэффициента относительной скорости движения

V

Г, _ расгв ^l\ i ~

s.

(1.3)

C'l

где S,

рлетв

расстояние, пройденное растворенным соединением; 5_СТ —расстоя­ние, пройденное стандартным веществом (смесью).

В качестве стандартного можно использовать одно из веществ разделяемой смеси. Получаемые значения R_cy являются более воспроизводимыми, чем величина R_f.

Разделение веществ методом бумажной хроматографии проводят в специальных камерах. Для получения одномерной хроматограммы на полоску хроматографической бумаги шириной 1,5—5 см и длиной 20—70 см наносят исследуемый раствор (0,005—0,007 см³) на рассто­янии нескольких сантиметров от верхнего края бумаги, который по­гружают в растворитель (нисходящая хроматограмма), или исследуе­мый раствор наносят на расстоянии нескольких сантиметров от нижнего края бумаги, который погружают в ванночку с растворите­лем, а верхний конец закрепляют (восходящая хроматограмма).

При получении нисходящей хроматограммы (рис. 1.6) лист бу­маги подвешивают в камере, погрузив верхний край в кювету с растворителем. Под действием силы тяжести и капиллярных сил растворитель продвигается сверху вниз и по достижении края лис­та стекает на дно камеры. Чтобы поток был равномерным, ниж­ний край листа нарезают зубцами.

Восходящую хроматограмму (рис. 1.7) вследствие слабой меха­нической прочности бумаги подвешивают на специальных держа­телях. Растворитель поднимается до верхнего края листа бумаги за счет капиллярных сил. При этом все компоненты анализируе­мой смеси остаются в пределах листа. Это особенно важно в том

случае, когда разделяют веще­ства с неизвестной подвижнос­тью. Тогда по полученной хро­матограмме можно определить

Рис. 1.6. Камера для получения нисхо­дящей хроматографии:

а —общий вид камеры; расположение листа бумаги; / — кювета для растворителя; 2— стеклянная палочка для фиксации листа бумаги; J—антисифонная палочка; '/—под­ставка; 5 —лист бумаги; 6— камера; 7 — зуб­цы на бумаге

28

коэффициент распределения R'_f всех компонентов смеси.

Как только растворитель достигает намеченного рубежа, лист извлекают из камеры, от­мечают положение фронта ра­створителя и высушивают. По­скольку большинство веществ лишено окраски, их положе­ние на хроматограмме выявля­ют подходящим способом. На­пример, вещества, несущие ра­диоактивную метку, выявляют при помощи счетчиков им­пульсов; вещества, имеющие собственную флуоресценцию, выявляют при облучении УФ- светом (365 нм). Остальные ве­щества обычно обнаруживают по окрашенным продуктам, ко­торые образуются под действи­ем специфических реагентов. Так, аминокислоты и полипеп­тиды образуют с нингидрином хромофор, имеющий фиолетовую окраску.

Аффинная хроматография основана на установлении обрати­мых молекулярных взаимодействий, присущих биологически активным веществам. Этой способностью обладают иммунные, ферментные и гормональные системы; белки, которые могут пе­реносить различные малые молекулы (витамины, жирные кис­лоты и др.) после связывания этих молекул за счет сродства, и нуклеиновые кислоты, способные соединяться между собой или с некоторыми белками.

В аффинной хроматографии используют нерастворимый носи­тель, на котором иммобилизуется соединение, называемое лиган- дом. Он особым образом связывает подлежащий очистке продукт, находящийся в подвижной, обычно жидкой фазе. Лиганд удержи­вается за счет ковалентных связей, иногда пользуются ионным об­меном, адсорбцией, микроинкапсулированием и др.

Аффинная хроматография — разновидность адсорбционной, при которой связывание происходит в соответствии со специфически­ми свойствами двух молекул. Она основана на разных взаимодей­ствиях: ионных, водородных, гидрофобных и других в зависимос­ти от конформации и размера молекул.

В любом случае методы хроматографии основываются на всех возможных различиях молекул. Поскольку эти методы требуют соответствующего материально-технического оснащения, при вы-

в

Рис. 1.7. Камера для выполнения восхо­дящей хроматографии:

а, б— способы фиксации бумаги в держа­теле; в, г—способы размещения бумаги в камере

29

vu^ ^tiNpciHuiu варианта или способа следует обращать вни­мание на доступность оборудования, стоимость и дефицитность реактивов.

Для практики анализа белковых веществ хроматографическими методами рекомендуется использовать данные табл. 1.3, которые дают информацию о предпочтительности того или иного метода при определении белков, пептидов, аминокислот.

Таблица 1.3 Краткое руководство к выбору методов хроматографии

Хроматографический метод

Белки

Пептиды

Аминокислоты

1. Распределительная на бумаге — + +

2. Адсорбционная в тонком слое — ++ + +

3. Проникающая +++ + —

4. Газожидкостная — — ++

5. Ионообменная + ++ +++

6. Аффинная +++ + —

Примечание: «—» — не применяются; «+» — применяются, «++» — до­статочно часто применяются; «+++» — часто применяются, наиболее пред­почтительны.

С развитием современной теории питания, необходимостью разработки биологически полноценных белковых пищевых про­дуктов на основе комбинирования и имитации знания и практи­ческий навык в анализе белковых веществ имеют огромное значе­ние для решения актуальных задач отрасли. В настоящее время существует множество подходов и методов хроматографии, однако лишь некоторые из них доступны и нашли достаточно широкое распространение.

Для создания продуктов с заданным составом аминокислот, расчета показателей биологической ценности необходима инфор­мация о полном составе аминокислот, т. е. их сумме в составе бел­ков, пептидов и свободных аминокислот.

Путем анализа свободных аминокислот можно прогнозировать свойства готовых изделий, так как многие из них являются сильными вкусообразователями. Экстрактивные азотистые веще­ства, присутствующие в мясе, по химической природе большей частью пептиды, также участвуют во вкусообразовании.

Таким образом, возникает необходимость общего и дробного анализов белковых веществ.

Наибольшее распространение получила колоночная хромато­графия для проведения проникающей или ионообменной хрома­тографии, а также распределительная хроматография на бумаге и адсорбционная в тонком слое.

30

Простейшее устройство для хроматографического разделения на колонках изображено на рис. 1.8.

Колонки — полые стеклянные трубки, размер которых зависит от цели работы и способа разделения. В основание колонки при­паивают пористую стеклянную пластинку или перфорированный диск. Необходимо следить за тем, чтобы «мертвое» пространство под диском, между ним и основанием колонки, а также внутрен­ний диаметр шлангов, по которым выходящий из колонки элюат поступает в коллектор фракций, было минимальным. В против­ном случае произойдет смешивание уже разделенных веществ. Коммерческие колонки снабжены специальными приспособлени­ями — концевыми адаптерами переменной длины, которые по­зволяют регулировать длину колонки и сводят к минимуму пере­мешивание элюируемых фракций.

Заполнив колонку до нужной высоты, закрывают нижний кран (зажим) и дают суспензии осесть, не допуская «высыхания» на­полнителя в колонке (для этого над верхним слоем сорбента все­гда должен находиться слой растворителя). Следят также за тем, чтобы верхний слой наполнителя имел гладкую горизонтальную поверхность. Для уменьшения взмучивания верхнего слоя при внесении в колонку образца над ним иногда помещают кружок фильтровальной бумаги или поролона. Колонку закрывают проб­кой с отводом или со стеклянной трубкой и присоединяют к ре­

Рис. 1.8. Принципиальная схема устройства для коло­ночной хроматографии:

7 — сосуд с раствором высокой концентрации; 2— сосуд-сме­ситель; 3 — магнитная мешалка; '/—перистальтический на­сос; 5— колонка; 6— УФ-детектор; 7— коллектор фракций

31

зервуару, содержащему элюирующий раствор. Для поддержания постоянного давления и сохранения постоянной скорости тока жидкости через колонку используют склянку Мариотта или насо­сы различных конструкций.

Образец можно вносить в колонку несколькими способами. Самый простой из них заключается в следующем: осторожно удаляют жидкость с поверхности наполнителя, оставляя слой в 1—2 мм; при помощи пипетки осторожно вносят образец и, от­крыв нижний кран, дают ему впитаться; остатки образца над сор­бентом смывают небольшой порцией элюента; после того как он впитается поверхностью наполнителя, добавляют новые порции элюирующего раствора, создавая слой в 5—10 см. Другой способ внесения образца, при котором избыток жидкости не удаляют из колонки, заключается в увеличении плотности раствора образца путем добавления сахарозы до концентрации 0,5 моль/дм³. Раствор образца при этом спускают под слой растворителя, в результате чего он быстро впитывается в верхний слой наполнителя.

После нанесения образца колонку соединяют с верхним резер­вуаром, путем изменения рабочего давления устанавливают необ­ходимую скорость истечения элюирующего раствора и с помощью коллектора начинают сбор фракций. Собирать фракции элюата необходимо с момента нанесения образца на колонку. Фракции можно собирать в пробирку по объему (с помощью сифонов), по определенному количеству капель или через определенные про­межутки времени.

Элюирование с колонок, как правило, проводят растворами, изменяя рН, ионную силу (концентрацию) или оба показателя од­новременно. При этом градиент рН и ионной силы может быть ступенчатым или непрерывным (плавным). При создании ступен­чатого градиента пользуются серией буферных растворов, пропус­каемых через колонку последовательно один за другим. При этом виде элюирования каждый из буферных растворов пропускают че­рез колонку до тех пор, пока концентрация белка в вытекающем из колонки элюате, пройдя через максимум, не снизится почти до исходных фоновых значений.

При непрерывном градиенте элюирования изменение ионной силы и (или) рН элюирующего раствора происходит постепенно, по линейной или нелинейной зависимости от объема протекаю­щей жидкости. Линейное изменение ионной силы или рН элюи­рующего раствора происходит тогда, когда эти параметры изменя­ются пропорционально объему протекающей жидкости. Получить линейный градиент можно с помощью прибора, состоящего из двух соединенных между собой одинаковых сосудов, установлен­ных на одном уровне (рис. 1.9, а). В сосуде 1 находится буферный раствор с определенным значением ионной силы (или рН), кото­рое должно быть достигнуто к концу опыта, в сосуде 2, из которо­го раствор поступает непосредственно в колонку, вначале нахо­дится исходный буферный раствор в том же объеме. Часто приме-

32

Рис. 1.9. Приборы для создания градиента концентрации:

а — линейного; б— «выпуклого»; в — «вогнутого»

няют «выпуклый» или «вогнутый» градиенты, при которых ионная сила раствора увеличивается или уменьшается соответственно экспо­ненциальной зависимости. Форму этих градиентов легко получить с помощью простых устройств, изображенных на рис. 1.9, б, в.

33

Рис. 1.10. Установка для коло­ночной хроматографии с автома­тическим сбором фракций:

/—микронасос; 2— пульт управле­ния; 3— колонка; 4— вращающийся коллектор — сборник фракций

Стекающий из колон­ки растворитель собира­ют небольшими порция­ми через определенные промежутки времени с помощью специальных ав­томатических коллекто­ров — сборников фрак­ций (рис. 1.10). Содер­жимое каждой пробирки подвергают анализу, опре­деляя концентрацию ком­понентов смеси (чаще все­го определяют оптичес­кую плотность раствора). По полученным данным строят график зависимости концентрации компонента (или оптической плотно­сти) от объема прошедшего через колонку раствора.