1. Определение массовой доли белка методом лоури

1.1. МЕТОД ЛОУРИ В МОДИФИКАЦИИ ДЭВЕНИ И ГЕРГЕЙ (1976 г.)

Приготовление реактивов. Реактив А. Раствор Na,CO. массовой долей 2 % в растворе NaOH молярной концентрацией 0,1 моль/дм³.

Реактив В. Раствор CnS0₄ • Н-,0 массовой долей 0,5 % в растворе тартрата натрия с массовой долей 1 %.

Реактив С. Получают смешиванием 60см³ реактива А и 1 см³ реактива В (готовят непосредственно перед определением).

Реактив Д. Непосредственно перед использованием ре­актив Фолина—Чокалтеу титруют по фенолфталеину раство­ром гидроксида натрия известной молярной концентрации и по полученным результатам разбавляют до концентрации раство­ра 1 моль/дм³ (приготовление реактива Фолина см. главу III, лаб. раб. № 2).

Порядок проведения анализа. К 0,2 см³ исследуемого раствора, содержащего 5—100 мкг белка, прибавляют 1 см³ реактива С, сме­шивают и через 10 мин быстро вносят 0,1 см³ реактива Д, встряхи­вают и оставляют при температуре (20 ± 5) °С на 30 мин, а затем снимают показания на спектрофотометре при X = 750 нм.

Построение калибровочного графика. Содержание белка в растворе определяют по калибровочному графику, который строят с исполь­зованием раствора тирозина известной концентрации. Для приго­товления стандартного раствора 20 мг кристаллического тирозина растворяют в 200 см³ раствора соляной кислоты молярной концент­рацией 0,2 моль/дм³. Калибровочный график строят, используя раст­воры тирозина с рекомендуемой массовой концентрацией:

Содержание тиро- Объем раствора зииа, мкг тирозина. см^;

Объем раствора соляной кислоты молярной копией- Значение экстинкции трацией 0,2 моль/дм', см^;

10

20 30 40 50 60 70 80 90

0,1

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2

0,113

0,2 0,3 0.4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

0.1

0,208 0,316 0,401 0,511 0,614 0.706 0,817 0,900

63

Рис. 1.20. Калибровочный график для определения белка по метолу Лоури в модификации Л'звени--Гергей

0

60 80 с, мкг /см тирозина, а на оси ординат —

По результатам определения строят калибровочный график (рис. 1.20). откладывая на осп абсцисс концентрацию стан­дартных растворов (мкг/см')

20 40

значения оптической плотнос­

ти при 750 нм. По графику находят концентрацию тирозина, ко­торая соответствует найденной оптической плотности.

Приготовление реактивов. Реактив А. Смесь растворов: Na₂C0₃ молярной концентрацией 1 моль/дм³, NaOH молярной концентрацией 1 моль/дм³ и CuS0₄ с массовой долей 0,5 % (со­держит 1 % тартрата калия-натрия) в соотношении 10:5:1.

Порядок проведения анализа. В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 2—5 см³ щелочного экстракта белков образца, при­готовленного в соответствии с прописью подготовки проб, при­бавляют 15 см³ раствора тартрата калия-натрия молярной концен­трацией 1 моль/дм³ и доводят объем дистиллированной водой до метки. В зависимости от массового содержания азота для фото­метрического определения используют 0,2 см³ (или более) приго­товленного раствора. Объем доводят до 10 см³ с помощью реакти­ва А. По истечении 30 мин измеряют оптическую плотность раст­вора на спектрофотометре при X = 750 нм. Для определения содер­жания азота строят калибровочный график.

Приготовление реактивов. Биуретовый реактив. 0,9 г тар­трата калия-натрия, 3,0 г сульфата меди и 5,0 г иодида калия растворяют в 1000 см³ раствора гидроксида натрия молярной кон­центрацией 0,2 моль/дм³.

Порядок проведения анализа. Щелочной экстракт белков объемом 2 см³ смешивают с 15 см³ биуретового реактива. После

1.2. МЕТОД ЛОУРИ В МОДИФИКАЦИИ ЛАСТЫТЬ (1978 г.)