Структура днк по Уотсону и Крику.

Успешное использование рентгеноструктурного анализа для изучения биологической макромолекулы дало ключ к разгадке структуры ДНК.

Одним из первых исследователей, высказавшим некоторые соображения о трехмерной структуре ДНК, был Астбюри ( именно он в начале 40-х годов ввел термин «молекулярная биология»). Три группы ученых продолжили работу Астбюри по изучению ДНК, с помощью рентгеноструктурного анализа. Первую группу возглавил Полинг, их работа не увенчалась успехом. Вторую группу возглавил Уилкинс, его сотрудница Розалинда Франклин смогла выделить высокоориентированные нити ДНК, которые позволили получить качественную рентгенограмму ДНК. На ней было видно, что ДНК состоит из двух цепей. Кроме того, с ее помощью был подтвержден факт расстояния между нуклеотидами в 3,4 А.

В 1953 году эту рентгенограмму увидели Джеймс Уотсон и Френсис Крик, которые возглавляли третью группу ученых.

Основываясь на данных Чаргаффа и материалах рентгеноструктурного анализа, Уотсон и Крик пришли к следующим выводам:

1) молекула ДНК – это биополимер, мономером которой является нуклеотид;

2) молекула ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепей, взаимно обвитых одна вокруг другой

3) ДНК имеет форму правильной спирали;

4) спираль имеет диаметр около 20А;

5) спираль делает один полный оборот каждые 34А вдоль оси и, поскольку межнуклеотидное расстояния равно 3,4 А, содержит десять нуклеотидов на 1 оборот.

6) для того, чтобы двухцепочечная спираль имела постоянный диаметр должна существовать комплементарная взаимосвязь между двумя нуклеотидными рядами ( на против пуринового основания должно быть пиримидиновое: А-Т; Г-Ц)

7) для обеспечения термодинамической стабильности спирали должны возникать водородные связи между пуриновыми и пиримидиновыми основаниями (между аденином и тимином две водородные связи, между гуанином и цитозином три.)

Исходя из этих условий они построили модель.

ДНК представляет собой спираль из двух скрученных одна вокруг другой полинуклеотидных цепей, причем цепи эти антипараллельные.

Двойственность в молекуле ДНК объясняло принципы самовоспроизведения молекул на основе матричного синтеза. Специфика взаимоположений азотистых оснований в молекуле ДНК стало трактоваться как генетический код.

ДНК и хромосомы. Доказательства генетической функции ДНК.

Генетическая функция ДНК впервые была доказана в опытах Эвери.

1) Содержание ДНК в любой клетке или организме строго постоянно и не зависит от условий внешней среды.

2) Чем сложнее организм, тем больше ДНК содержится в его клетках. Бактерии около 0,01* 10^-6 мкг ДНК на клетку. Высшие организмы 6* 10^-9 мкг на клетку.

3) Бактериофаги, имеют лишь несколько генов и содержат очень мало ДНК и поэтому они часто используются для экспериментов. для определения генетической функции ДНК.

Нуклеотидный состав ДНК

1) Препараты ДНК разных тканей одного организма имеет одинаковый нуклеотидный состав.

2) Нуклеотидный состав разных видов различен. Он не зависит от внешний условий.

3) ДНК близкий видов имеет весьма сходный состав.

Одним из важнейших функциональных элементов наследственного материала является хромосома.

Структурной основой хромосом служит комплекс ДНК-гистон. ДНК связана с гистонами ионными связями. Гистоны, входящие в состав эукариотических клеток это основные белки, с положительным зарядом. В настоящее время известно 5 фракций гистоновых белков, входящих в состав хроматина: гистоны Н1, Н2а,Н2в, Н3, Н4. Эти белки способны образовывать вместе с ДНК нуклеопротеид или первый уровень компактизации хроматина – нуклеосомы. Прохождение клеткой своего жизненного цикла связано с развертыванием и деспирализации хромосом в конце деления и спирализацией и скручиванием хромосом в начале деления. В начале деления из нуклеосом в результате спирализации и компактизации образуются нуклеомеры, из нуклеомер- хромомеры, из хромомер- хромонемы, а из хромонем- хромосомы. Образование хромосом в начале деления необходимо: во-первых для более правильного распределения генетической информации между дочерними клетками, во- вторых только в состоянии хромосомной организации между гомологичными хромосомами возможно прохождение коньюгации и кроссинговера во время образования гамет. Следовательно этот процесс является не только механизмом поддержания постоянства число хромосом, но и способствует перекомбинации генетической информации и увеличения комбинативной изменчивости.

При всей сложности организации хромосом показано, что главным субстратом, в котором содержится генетическая информация является ДНК. Во время интерфазы ядро находится в состоянии наивысшей метаболической и синтетической активности. Во время интерфазы проявляется действие генов, происходит ауторепродукция ДНК, синтез всех видов РНК и биосинтез белка.

Для того, чтобы ответить на вопрос о том каким образом информация, закодированная в ДНК и обеспечивающая соединения аминокислот в специфической последовательности, попадает при синтезе белка в рибосомы необходимо более подробно рассмотреть строение и функции и других нуклеиновых кислот.

РНК и их роль в биосинтезе белка.

РНК представляет собой одноцепочную полинуклеотидную цепь, сильно напоминающую цепь ДНК. Основное химическое различие между ДНК и РНК состоит в том, что в РНК углеводом нуклеотидов является рибоза и одним из 4-х азотистых оснований служит не тимин, а урацил. Оказалось, что эти два довольно незначительных химических различия (дополнительная гидроксильная группа в углеводе РНК и дополнительная метильная группа в одном из пиримидинов ДНК) имеет большое значение для биологической роли, выполняемой этими двумя полинуклеотидами.

ДНК – не белок, она не может быть ферментом и не может служить катализатором для образования полипептидов. ДНК стабильна, содержит генетический материал, она всё время находится в хромосомах или в другой структуре и не выходит за их пределы.

Информация заложенная в ДНК, которая служит матрицей при определении специфичности полипептида должна каким то образом реализоваться в клетке. Поэтому значительно большую роль при биосинтезе белка играют четыре типа различных РНК.

Информационная ( матричная) РНК

Допущение, что ДНК сама управляет процессом построения нити полипептида, в общем случае не может быть правильным. Гетерокаталитическое действие ДНК представляет собой двустадийный процесс. На первой стадии каждый участок (ген) ДНК служит матрицей для синтеза молекул РНК, на которой совершенно точно транскрибируется (переписывается) последовательность нуклеотидов соответствующего гена и, следовательно, закодированная в них информация о последовательности аминокислот. Затем молекулы РНК перемещаются в цитоплазму, где на второй стадии гетерокаталитической функции их нуклеотидная последовательность транслируется (переводится) в полипептидную цепь с предетерминированной первичной структурой.

Образование информационной РНК происходит в результате транскрипции. Механизм транскрипции значительно прояснился после открытия в 1960 г. С. Вейссом, Ж. Гурвицем и О. Стивенсом фермента РНК-полимеразы.

В присутствии ДНК матрицы РНК- полимераза катализирует превращение рибонуклеозидтрифосфатов в полирибонуклеотидную цепь. АТФ, ГТФ, ЦТФ и УТФ полимерезуются в РНК за счет образования эфирной связи между ближайшими к рибонуклеотиду 5, -фосфатом и 3, -гидроксильной группой другого нуклеозидтрифосфата с одновременным соединением остальных двух фосфатов в виде неорганического пирофосфата.

Матрицей для синтеза м-РНК может служить только одна цепь ДНК. Это определяется ходовой последовательностью нуклеотидов промотора ( участка ДНК с которым соединяется РНК- полимераза), такая цепь называется кодогенной (3`-5`). Это означает, что каждое пуриновое и пиримидиновое основание ДНК- матрицы должно присоединить и удерживать ( за счет специфических водородных связей) свободный нуклеотид, несущий комплементарное пуриновое или пиримидиновое основание.

После того, как транскрибированная молекула РНК покидает ДНК- матрицу, чтобы быть использованной при синтезе белка, две расплетенные нити ДНК снова соединяются. Позади молекулы РНК- полимеразы немедленно восстанавливается структура ДНК. Удлинение молекулы м-РНК продолжается до тех пор, пока фермент не встретит на своём пути специфическую нуклеотидную последовательность ДНК – терминатор транскрипции (стоп-сигнал). В этой точке полимераза отделяется от матричной ДНК и от вновь синтезированной молекулы РНК.

Завершённая цепь РНК отделяется от ДНК матрицы в виде свободной одноцепочечной молекулы.

В клетках высших эукариот большинство РНК, прежде чем покинуть ядро и перейти в цитоплазму в виде м-РНК, претерпевают существенные изменения.

У эукариотов в процессе транскрипции синтезируется незрелая или про м-РНК. Она является точной копией одной из цепей ДНК, и также как и ДНК содержит неинформационные участки- интроны и информационные участки- экзоны. Для созревания м-РНК происходит сплайсинг. Сплайсинг - это удаление с помощью фермента последовательностей РНК, соответствующих интронам и соединение с помощью фермента лигазы экзонов. Далее м-РНК выходит из ядра и направляется к месту биосинтеза белка- рибосомам.

Как же функционируют рибосомы, обеспечивая правильный перенос информации от матричной РНК? Рибосомы- рибонуклеопротеидные частицы, так они были названы Робертсом. Рибосомы прокариотов имеют диаметр около 20 нм и содержат вдвое больше р-РНК, чем белка. Константа седиментации у них порядка 30S и 50 S. Рибосомы эукариотов несколько больше по размерам, а относительное содержание РНК меньше. Константа седиментации у них порядка 70 и 80 S Структурные исследования рибосом показали, что они состоят из двух субъединиц, и что обе субъединицы содержат р-РНК и белок. Соединение субъединиц рибосом вместе происходит во время трансляции, при наличии м- РНК и большого количества ионов магния.

Рибосомная РНК высших организмов седиментирует как два отдельных компонента 18s и 28s . Меньшая молекула РНК как позднее было доказано входит в состав малой субъединицы рибосомы, а большая в состав большой субъединицы.

Рибосомы являются именно тем местом, где происходит сборка аминокислот в полипептиды. Этот было подтверждено в лаборатории Пола Замечника в Главном Массачусетском госпитале. Там была разработана воспроизводимая бесклеточная система, содержащая рибосомы, аминокислоты и АТФ, которая включала аминокислоты в белки. Используя эту систему, Хогленд сделал два важных открытия. Во- первых, он показал, что аминокислоты сначала активируются АТФ, образуя богатые энергией комплексы аминокислота- АМФ. Во-вторых он показал, что активированные аминокислоты затем переносятся на молекулы т-РНК в активированной форме. Эти соединения (аминоацил- т-РНК ) затем функционируют как непосредственные промежуточные соединения при образовании пептидной связи. Вскоре после открытия т- РНК было установлено, что молекулы т- РНК специфичны для определенной аминокислоты.

Для белкового синтеза необходимо 2 фактора: термолабильный и термостабильный. Термостабильный низкомолекулярный фактор назвали т- РНК. Аминоацил т-РНК связывается с рибосомой и служит донором аминоацильного остатка, что приводит к удлинению полипептидной цепи.

Транспортная (растворимая, или адаптерная) РНК

В цитоплазме кроме м- РНК и р-РНК содержится другой тип РНК, с относительно низким молекулярным весом, примерно равным 18000, что приблизительно соответствует 67 нуклеотидам. Эта РНК не осаждается при центрифугировании вместе со структурными элементами клетки, она называется растворимой РНК, или тРНК. тРНК также образуется в ядре. Основная функция этой РНК заключается в переносе аминокислот находящихся в цитоплазме к рибосомам, то есть к месту синтеза полипептида. Аминокислоты к рибосомам поступают по одной, причём каждая аминокислота прикреплена к молекуле т- РНК. Концевые нуклеотиды у всех молекул т- РНК одинаковы, один конец оканчивается гуанином, а другой – последовательностью оснований – Ц-Ц-А.

Все молекулы тРНК имеют одинаковые размеры: длину 100 А и ширину 20 А. Различаются они в других отношениях, по-видимому, по их внутренним свойствам, т. е. по составу оснований или их последовательности, образуя около 20 различных типов, причём каждая из них способна переносить только одну из аминокислот, обычно встречающихся в белках. В состав т-РНК входят обычные нуклеотиды и необычные такие как псевдоурацил и инозин. Между ее нуклеотидами возникают водородные связи, поэтому на некоторых участках она является двухцепочечной. В тех же местах, где водородных связей не образовано нуклеотиды располагаются в одну цепь и там находятся так называемые « петли». Особое значение имеет антикодоновая петля, она состоит из трех нуклеотидов, которые соответствуют кодону т.е. трем нуклеотидам м- РНК. При соответствии кодона и антикодона между нуклеотидами возникают водородные связи, а принесенная т- РНК аминокислота занимает свое место в синтезированном полипептиде.

Обнаружено, что для образования комплекса аминокислота – транспортная РНК каждая из 20 кислот должна быть активирована перед тем, как она прикрепится к специфической транспортной РНК. Активация заключается в соединении карбоксильной группы аминокислоты с 2'- или 3'-гидроксильной группой аденозинтрифосфата (АТФ), что сопровождается отщеплением двух фосфатных остатков в виде пирофосфата. Эта реакция может быть суммирована следующим образом: аминокислота + АТФ =аминоациладенилат + пирофосфат. Реакция прикрепления может быть суммирована так: т-РНК + аминоациладенилат = аминоацил-тРНК + адениловая кислота. Один фермент может участвовать как в активации аминокислоты, так и в её прикреплениях к т- РНК. Транспортная РНК функционирует и как адаптер, причём конец, который несёт транспортируемую аминокислоту и имеет последовательность «аминокислота А-Ц», остаётся достаточно гибким для того, чтобы достигнуть нужной области и образовать пептидную связь. Синтез полипептидной цепи происходит в 4 этапа.

Биосинтез белка.

Теперь, когда мы изучили строение и функции ДНК и РНК, мы можем перейти к рассмотрению одного из основных вопросов: каким образом считывание генетической информации, заключённой в нуклеотидных последовательностях м-РНК, приводит к тому, что аминокислоты собираются в полипептидную цепь, в которой аминокислотные остатки расположены в специфической последовательности?

1 На первой стадии белкового синтеза происходит транскрипция ( переписывание информации с одной из цепей молекулы ДНК на про- м РНК), процесс этот как уже было сказано выше происходит под действием фермента РНК- полимераза.

2 Вторая стадия получила название процессинга и она заключается образовании зрелой или м- РНК, которая содержит только информативные участки ( экзоны). Обе эти стадии происходят в ядре. Последующие стадии биосинтеза белка осуществляются в цитоплазме.

3 Трансляция – эта стадия белкового синтеза протекает в несколько стадий и требует большого количества специфических ферментов или кофакторов.

На первой стадии белкового синтеза, которая называется стадией активации и протекает в цитоплазме аминокислоты узнаются соответствующими т-РНК и активизируются за счет энергии АТФ. Необходимыми компонентами для этой стадии являются аминокислоты, т-РНК, фермент аминоацил тРНК – синтетаза, АТФ и ионы магния.

Вторая стадия получила название инициация полипептидной цеп. На этой стадии образуется инициирующий комплекс при этом матричная РНК и первая или инициирующая, аминоацил-т-РНК связываются со свободной рибосомной 30S – субъединицей, а затем уже происходит связь с 50S субъединицей рибосом. Необходимыми компонентами этой стадии являются:

- инициирующая аминоацил-т-РНК ( у бактерий это формилметеонил –т-РНК, у эукариот это метил-т-РНК);

- мРНК;

- ГТФ;

- ионы магния;

- субъединицы рибосом;

- факторы инициации.

На третьей стадии белкового синтеза белковая цепь удлиняется ( элонгация) путем последовательного присоединения новых аминоацильных остатков, которые переносятся от соответствующих аминоацил-т-РНК. Порядок и расположение аминоацильных остатков в цепи полипептида определяется последовательностью кодонов м-РНК. Рост пептидных цепей начинается с N концевого остатка. Новые остатки присоединяются к концевой COOH- группе пептидил –т-РНК.

При образовании очередной пептидной связи молекула м- РНК и пептидил –т-РНК перемещаются на рибосоме, так чтобы другой кодон занял рабочее положение. Для прохождения этой фазы необходимо:

- различные аминоацил-т-РНК, выбор, которых определяется кодонами м-РНК;

-ионы магния;

-ГТФ;

- факторы элонгации.

Заключительная стадия трансляции называется терминации, на ней происходит завершение синтеза полипептида. Сигналом терминации служат определенные кодоны м-РНК ( стоп- кодоны) , когда до них доходит очередь, синтез полипептида прекращается и готовая полипептидная цепь отделяется от рибосомы. Отделение полипептидил-т-РНК от рибосомы происходит при участии специфического фактора освобождения. Затем свободная 70S рибосома сходит с м-РНК и после диссоциации на 50S и 30S – субъединицы может включиться в новый цикл.

4. Эпигенез или посттрансляционная модификация полипептида. Это завершающий этап реализации генетической информации, в результате которого из синтезированного полипептида образуется функционально активная молекула белка. При этом первичный полипептид может претерпевать изменения, заключающиеся в удалении инициирующей аминокислоты и химической модификации отдельных аминокислот. Затем происходит формирование вторичной и третичной структуры белка. В случае белковых молекул, состоящих из нескольких полипептидов (например гемоглобин) происходит образование комплексной четвертичной структуры белка.

Построение трёхмерных биоструктур на основе «одномерной» генетической информации становится возможным благодаря способности полипептидных цепей самопроизвольно принимать специфическую трёхмерную конформацию, определяемую аминокислотной последовательностью. Определённые молекулы белков могут самопроизвольно связываться друг с другом, образуя надмолекулярные структуры, например мультиферментные комплексы.

В настоящее время ученым понятны общие черты протеосинтеза. Для синтеза белка требуется упорядоченное взаимодействие трех классов РНК: рибосомной, транспортной и матричной. Наиболее удовлетворительным является осознание того, что все этапы репликации белка протекают с участием хорошо изученных химических сил. Вероятнее всего грядущий прогресс в понимании синтеза белка и его значения для медицины приведет к открытию столь же простой, вполне определенной и легкой для понимания химической основы этого процесса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Рассматривая молекулярную логику живого состояния, мы ни разу не столкнулись с нарушением известных физических законов или с необходимостью сформулировать какие-то новые законы. Быть может, когда-нибудь нам удастся выяснить происхождение и эволюцию биомолекул и ферментативных реакций, связующих воедино многочисленные химические процессы, протекающие в клетке. Лишь тогда мы сможем понять, как возникла молекулярная логика живого.

Основная литература.

1. А.П. Пехов. Биология и общая генетика . Москва. Издательство Российского университета дружбы народов 1994г.

2. В.Н. Ярыгин. Биология в 2-х томах. Москва Высшая школа. 2006г.

3. Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. Биология в 3-х томах. Москва. Мир. 1996г.

4. Г. Стент. Молекулярная генетика. Издательство Мтр. Москва 1974г.

Дополнительная литература.

1. Альберт Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки .- М.: Мир, 1994. –Т. 1,2,3.

2. Бочков Н.П. Клиническая генетика .-М.: Медицина 1993.

3. Козлов С.И., Семанова Е.Е., Демикова Н.Н., Блиникова О.Е. Наследственные синдромы и медико-генетическое консультирование.-2-е изд.- М.: Практика, 1996

7. Контрольно-учебная карта внеаудиторной подготовки к занятию.

Ключевые вопросы темы	Цель	Вопросы для самоконтроля
1. ДНК. Строение, свойства и роль ДНК в клетке.	Знать химическую природу наследственного материала	-открытие нуклеиновых кислот в клетке; -установление роли ДНК в клетке (опыты по трансформации и трансдукции у бактерий) -правила комплементарности Чартгаффа; -модель строения ДНК Уотсона и Крика
2. РНК. Структура РНК, виды РНК и их функции.	Роль РНК в процессе реализации генетической информации	-химическое строение РНК; виды РНК
3.Генетический код – способ записи генетической информации. Свойства генетического кода.	Знать определение и свойства генетического кода.	определение генетического кода - свойства генетического кода: триплетность, вырожденность, неперекрываемость, универсальность. - принцип комплиментарности
4. ДНК и хромосомы	Знать химическую и структурную организацию хромосом	Хроматин и его химический состав; Типы хроматина; Уровни компактизации хроматина; Хромосомы. Типы хромосом, правила хромосом.
4. Этапы реализации генетической информации: - транскрипция - процессинг - трансляция - пострансляционные преобразования (эпигенез)	Знать сущность этапов биосинтеза белка; последовательность процессов реализации генетической информации.	Транскрипция. Особенности строения про- иРНК Процессинг. Преобразование про- иРНК в зрелую иРНК. Сущность трансляции и её этапы. Пострансляционные преобразования полипептида, роль ферментов в этом процессе.