1.1.2. Апоптоз

Генетический контроль беспечивает не только процессы деления, дифференцировки клеток и синтез белков, но также конечный путь жизненного пути клетки – её гибель. Процесс запрограмированой гибели клеток (их самоубийство) именуют апоптозом. Этот механим существенно отличается от патологической гибели клеток - некроза под влиянием внешних факторов (к примеру, воспаления).

Апоптоз включается в тех клетках и тогда, когда они не имеют идивидуальных, свойственных только им, механизмов гибели после оканчания генетически запрограммированного периода существования и выполнения своих функций. К примеру, специфическим механизмом гибели эритроцитов является их гемолиз в селезенке с последующим метаболизмом гемоглобина и выделеним конечных метаболитов через желчь в виде желчных пигментов, или слущивание эпителия кожи, роговицы. В отличие от этого «самоубийство» клетки с использованием общей схемы этого процесса, и получило название апоптоз.

Таким образом, апоптоз служит как обязательный процессом для обеспечения механизмов физиологической регенерации. Кроме того апоптоз имеет огромное значение для эмбрионального периода, а также для поддержания клеточного гомеостаза, который, как известно, вызывается различными сигналами: связыванием с рецепторами специфических киллерных лигандов, нехваткой факторов роста/выживания, повреждениями ДНК и разрушениями цитоскелета, гипоксией и другими неблагоприятными условиями.

Апоптоз – это биохимически специфический тип гибели клетки, характеризующийся прежде всего активацией нелизосомных эндогенных эндонуклеаз, расщепляющих ядерную ДНК на маленькие фрагменты. Кроме того апоптоз обеспечивается целым каскадом протеолитических реакций, приводящих к сжиманию и сморщиванию самой клетки, разрушению её цитоскелета. При этом изменяются свойства клеточной мембраны, благодаря чему к ней прикрепляются соседние клетки, фагоциты, которые в конечном итоге фагоцитируют и преваривают клетку. Все эти процессы обеспечивают поглощение фрагментов клетки без излияния ее содержимого наружу, а это обеспечивает сохранность целостности соседних клеток. При некрозе же поврежденная клетка обычно набухает и распадается в результате разрыва цитоплазматичесой мембраны. Изливающееся содержимое клетки вызывает воспалительную реакцию и повреждение соседних клеток. Важней всего, что при апоптозе сохраняется целостность плазматической мембраны и отсутствует воспалительный ответ. Поэтому апоптоз отличается от некроза не только по основным биохимическим и морфологическим показателям, но и по количеству вовлеченных в процесс клеток.

В табл. 2. приведены данные по сравнительной характеристике некроза и апоптоза.

Табл..2. Сравнительная характеристика некроза и апоптоза

Признак	Апаптоз	Некроз
Распространенность	Одиночная клетка	Группа клеток
Индукция	Активируется физиологическими/или патологическими стимулами	Различная в зависимости от повреждающего фактора
Биохимические изменения	Энергозависимая фрагментация ДНК эндогенными эндонуклеазами Лизосомы интактные	Нарушение или прекращение ионного обмена. Из лизосом высвобождаются ферменты
Распад ДНК	Внутриядерная конденсация с расщеплением на фрагменты	Диффузная локализация в некротизированной клетке
Целостность клеточной мембраны	Сохранена	Нарушена
Морфология	Сморщивание клеток и фрагментация	Набухание и лизис клеток
Воспалительный ответ	Нет	Обычно есть
Удаление погибших клеток	Поглощение (фагоцитоз) соседними клетками	Поглощение (фагоцитоз) нейтрофилами и макрофагами

Апоптоз начинается с активации семейства протеаз, кторые в неактивном состоянии именуются прокаспазами, а в активном – каспазами. Активированные каспазы в свою очередь активируют другие прокаспазы, что, в конечном счете, и приводит к быстрому разрушению внутриклеточных белков и самоуничтожению клетки. Близлежащие фагоциты заканчивают процесс уничтожения клетки, что бы на ее месте появилась обновленная клетка. Таким путем у взрослого человека устанавливается равновесие межде гибелью и новообразованием клеток, что именуется естественной физиологической регенерацией. Нарушение апоптоза может приводить к серьезным последствиям для организма, в том числе аутоиммунным, болезни Альцгеймера, нейродегенеративным заболеваниям, опухолевым процессам.

Каспазы (сейчас их обнаружено больше 10) - семейство цистеиновых протеиназ, расщепляющих свои субстраты по остаткам аспартатовой кислоты. По выполняемой каспазами функции их можно разделить на две основные группы: инициаторные каспазы и вторая группа - эффекторные каспазы. После того, как каспазы из первой группы активируют эффекторные каспазы, процесс, запущенный программой смерти, оказывается необратимым.

Морфология апоптоза. Для таких клеток в первую очередь характерно сжатие и потеря ею контактов с окружающими клетками и межклеточным матриксом. Хотя на ранних стадиях апоптоза плазматическая мембрана умирающей клетки остается интактной, но в тоже время такая клетка посылает сигналы, которые окружающиеми клетками узнаются, что, в конечном счете, и приводит к фагоцитированию ее. Одним из таких сигналов является экспозиция на поверхности фосфатидилсерина. Это происходит еще до снижения митохондриального трансмембранного потенциала и высвобождения цитохрома С. Для облегчения своего поглощения апоптотическая клетка вначале уменьшает свой объем, выкачивая ионы (К⁺, Сl^-, органические осмолярно активные соединения), что и обеспечивает один из путей сокращения ее объема, перестраивания цитоскелета. Затем плазматическая мембрана клетки начинает образовывать пузырьки, благодаря чему в отсутствие фагоцитоза происходит формированию апоптозных телец, содержащих конденсированные или морфологически неизмененные органеллы.

Фагоцитоз апоптотических клеток или телец осуществляется окружающими здоровыми клетками или чаще всего макрофагами. Апоптотические тельца быстро разрушаются в лизосомах, а окружающие клетки либо мигрируют в освободившееся пространство, либо делятся, чтобы заполнить его. Фагоцитоз активируется рецепторами на этих клетках: они захватывают и поглощают апоптотические клетки.

Весьма важным этипом апоптоза является и то, что сокращение клетки обычно сопровождается также уплотнением ядерного содержимого. Происходит агрегация хроматина и фрагментация ядра. После индукции апоптоза расщепление ДНК начинается с образования высокомолекулярных фрагментов, близких по размеру длине ДНК в петлях хромосом. Затем эти фрагменты обычно распадаются до нуклеосом и их олигомеров. И этим картина также отличается от таковой при некрозе клеток, где длина фрагментов ДНК варьирует. При апоптозе ядро может разрываться на два или несколько фрагментов. Фрагментация ДНК в нуклеосомах происходит под действием кальций чувствительной эндонуклеазы. Кстати эндонуклеаза в некоторых клетках находится постоянно (например, в тимоцитах), где она активируется появлением в цитоплазме свободного кальция, а в других клетках синтезируется перед началом апоптоза.

Большинство из вышеперечисленных изменений можно легко заметить и под обычным микроскопом. Апоптоз имеет свои отличительные морфологические признаки, как на светооптическом, так и на ультраструктурном уровне. При окраске гематоксилином и эозином апоптоз определяется в единичных клетках или небольших группах клеток. Апоптотические клетки выглядят как округлые или овальные скопления интенсивно эозинофильной цитоплазмы с плотными фрагментами ядерного хроматина. Поскольку сжатие клетки и формирование апоптотических телец происходит быстро и также быстро они фагоцитируются, распадаются или выбрасываются в просвет органа, то на гистологических препаратах он обнаруживается в случаях значительной выраженности этих процессов. Еще раз подчеркнем, что апоптоз - в отличие от некроза - никогда не сопровождается воспалительной реакцией, а это также затрудняет его гистологическое выявление.

А вот при электронно-микроскопическом исследовании изменение морфологических признаков выявляются более четко.

Апоптоз принимает участие в следующих физиологических и патологических процессах:

1. Запрограммированном разрушение клеток во время эмбриогенеза (включая имплантацию, органогенез). Несмотря на то, что при эмбриогенезе апоптоз не всегда является отражением «запрограммированной смерти клетки», это определение апоптоза широко используют различные исследователи.

2. Гормон-зависимой инволюции органов у взрослых, например, отторжение эндометрия во время менструального цикла, атрезии фолликулов в яичниках в менопаузе и регрессия молочной железы после прекращения лактации.

3. Удаление некоторых клеток при пролиферации клеточной популяции.

4. Гибели отдельных клеток в опухолях, в основном при ее регрессии, но также и в активно растущей опухоли.

5. Гибели клеток иммунной системы, как В-, так и Т-лимфоцитов, после истощения запасов цитокинов, а также гибели аутореактивных Т-клеток при развитии в тимусе.

6. Патологической атрофии гормон-зависимых органов, например, атрофии предстательной железы после кастрации и истощении лимфоцитов в тимусе при терапии глюкокортикоидами.

7. Патологической атрофии паренхиматозных органов после обтурации выводных протоков, что наблюдается в поджелудочной и слюнных железах, почках.

8. Гибели клеток, вызванных действием цитотоксических Т-клеток, например, при отторжении трансплантата и болезни «трансплантат против хозяина».

9. Повреждениие клеток при некоторых вирусных заболеваниях, например, при вирусном гепатите, когда фрагменты апоптотических клеток обнаруживаются в печени, как тельца Каунсильмана.

10. Гибели клеток при действии различных повреждающих факторов, которые способны вызвать некроз, но действующих в небольших дозах, например, при действии высокой температуры, ионизирующего излучения, противоопухолевых препаратов.

Регуляция апоптоза. В настоящее время выявлено большое число генов, которые кодируют вещества, необходимые для регуляции апоптоза. Многие из этих генов сохранились в ходе эволюции – от круглых червей до насекомых и млекопитающих. Некоторые из них обнаруживаются также в геноме вирусов. Таким образом, основные биохимические процессы апоптоза в разных экспериментальных системах (исследования ведутся на круглых червях и мухах) являются идентичными, поэтому результаты исследований можно прямо переносить на другие системы (например, организм человека).

Апоптоз регулируeтся: автономными механизмами и внешними факторами.

Автономный механизм апоптоза. При развитии эмбриона различают три категории автономного апоптоза: морфогенетический, гистогенетический и филогенетический.

Морфогенетический апоптоз участвует в разрушении различных тканевых зачатков. Примерами его являются:

разрушение клеток в межпальцевых промежутках;

когда формируется твердое небо, то гибель клеток приводит к разрушению избыточного эпителия что и обеспечивает последующее слияние небных отростков;

гибель клеток в дорсальной части нервной трубки во время смыкания необходимая для достижения единства эпителия двух сторон нервной трубки и связанной с ними мезодермы.

Нарушение морфогенетического апоптоза в этих трех локализациях приводят к развитию синдактилии, расщеплению твердого неба и spina bifida соответственно.

Гистогенетический апоптоз наблюдается при дифференцировке тканей и органов, что происходит, например, при гормональнозависимой (под влиянием тестостерона) дифференцировке половых органов из тканевых зачатков. Так, у мужчин клетками Сертоли в яичках плода синтезируется гормон, который вызывает путем апоптоза регрессию мюллеровых протоков (из которых у женщин формируются маточные трубы, матка и верхняя часть влагалища).

Филогенетический апоптоз участвует в удалении рудиментарных структур у эмбриона, например, пронефроса.

При различных состояниях может наблюдаться как ускорение, так и замедление апоптоза.

Несмотря на то, что апоптоз могут активировать различные факторы, характерные для определенных типов клеток, однако конечный путь апоптоза регулируется точно установленными генами и является общим, независимо от причины активации апоптоза. Все факторы, усиливающие или ослабляющие апоптоз, могут действовать прямо на механизм гибели клетки, опосредованно, путем влияния на регуляцию  транскрипции.

Воздействие внешних факторов. Апоптоз может регулироваться действием многих внешних факторов, которые ведут к повреждению ДНК. При невосстановимом повреждении ДНК путем апоптоза происходит элиминация потенциально опасных для организма клеток. В данном процессе большую роль играет ген супрессии опухолей р53. К активации апоптоза также приводят вирусные инфекции, нарушение регуляции клеточного роста, повреждение клетки и потеря контакта с окружающими или основным веществом ткани. Апоптоз – это защита организма от персистенции поврежденных клеток, которые могут оказаться потенциально опасными для многоклеточного организма. При стимуляции тканей каким- либо митогеном ее клетки переходят в состояние повышенной митотической активности, которая обязательно сопровождается некоторой активацией апоптоза. Судьба дочерних клеток (выживут они или подвергнутся апоптозу) зависит от соотношения активаторов и ингибиторов апоптоза: ингибиторы включают факторы роста, клеточный матрикс, половые стероиды, некоторые вирусные белки; активаторами являются - недостаток факторов роста, потеря связи с матриксом, глюкокортикоиды, некоторые вирусы, свободные радикалы, ионизирующую радиацию. При воздействии активаторов или отсутствии ингибиторов происходит активация эндогенных протеаз и эндонуклеаз. Это приводит к разрушению цитоскелета, фрагментации ДНК и нарушению функционирования митохондрий. Клетка сморщивается, но клеточная мембрана остается интактной, однако повреждение ее приводит к активации фагоцитоза. Погибшие клетки распадаются на небольшие, окруженные мембраной, фрагменты - апоптотические тельца.

В некоторых случаях влияние этих факторов на апоптоз является решающим (например, при глюкокортикоид-зависимом апоптозе тимоцитов), а в других не имеет особой важности (например, при Fas- и TNF-зависимом апоптозе). В процессе регуляции апоптоза принимает участие большое количество генетически контролируемых веществ.

Внеклеточные факторы также могут активиовать рецепторы, которые запусают апоптоз. В настоящее время наиболее хорощо изучены два таких фактора – это Fas и TNF (tumor necrosis factor). Fas – межмембранный белок, который выделяется из Т-лимфоцитов. Когда он присоединяется к своему рецептору, то происходит ативация каскада внутриклеточных энзимных реакций, которые и обеспечивают «разборку» клетки.

Описано несколько путей реализации апоптоза.

1. Важное место занимает путь, опосредованный физиологическими индукторами, действие которых реализуется через клеточные рецепторы, специально предназначенные для включения программы апоптоза. Этот путь передачи сигнала запрограммированной клеточной смерти схематически можно изобразить следующим образом: индукторы ==> рецепторы ==> адаптеры ==> инициирующие каспазы ==> регуляторы ==> эффекторные или казнящие каспазы.

Так, рецептор, обозначаемый Fas, взаимодействуя с соответствующим лигандом (лигандом FasL), трансмембранным белком Т-киллера, активируется и запускает программу смерти клетки, инфицированной вирусом. Тем же путем при взаимодействии с лигандом FasL на поверхности ТН-1-лимфоцитов или с антителом к Fas-рецептору погибают ставшие ненужными выздоровевшему организму В лимфоциты, продуценты антител, несущие Fas-рецептор. FasL- лиганд, относящийся к многочисленному семейству фактора некроза опухолей (TNF).

2. Существует путь передачи сигнала апоптоза с участием эндоплазматического ретикулума (ЭР). В ЭР локализована прокаспаза-12. Нарушение внутриклеточного Ca²⁺-гомеостаза добавкой Ca²⁺-ионофорного антибиотика А23187 ведет к апоптозу клеток, вызванному превращением прокаспазы-12 в каспазу-12. Полагают, что ЭР-зависимый апоптоз связан с болезнью Альцгеймера.

3. Цитотоксические лимфоциты, Т-киллеры могут вызывать апоптоз у инфицированных клеток с помощью белка перфорина. Полимеризуясь, перфорин образует в цитоплазматической мембране клетки-мишени трансмембранные каналы, по которым внутрь клетки поступает смесь сериновых протеаз. Существенным компонентом этой смеси является В-протеолитический фермент, превращающий прокаспазу-3 в активную каспазу-3.

4. Высвобождаемый из митохондрий цитохром С вместе с цитоплазматическим фактором APAF-1 (apoptosis protease activating factor-1) участвует в активации каспазы-9. APAF-1 - белок с молекулярной массой 130 кДа, содержащий CARD-домен (caspase activation and recruitment domain) на N-конце и 12 повторяющихся аминокислотных последовательностей на С-конце, образует комплекс с прокаспазой-9 в присутствии цитохрома С и ATФ.

Снижение интенсивности апоптоза. Продукт р53 гена следит за целостностью генома при митозе. При нарушении целостности генома клетка переключается на апоптоз. Наоборот, белок bcl-2 ингибирует апоптоз. Таким образом, недостаток р53 или избыток bcl-2 приводит к накоплению клеток: эти нарушения наблюдаются в различных опухолях. Изучение факторов регулирующих апоптоз имеет важное значение в разработке лекарственных препаратов, усиливающих гибель клеток злокачественных новообразований. Аутоиммунные заболевания могут отражать нарушения в индукции апоптоза лимфоидных клеток, способных реагировать с собственными антигенами. Например, при системной красной волчанке наблюдается нарушение Fas-рецепторов на клеточной поверхности лимфоцитов, что ведет к активации апоптоза. Некоторые вирусы повышают свою выживаемость путем ингибирования апоптоза инфицированных клеток, например, вирус Эпштейна-Барра может воздействовать на обмен bcl-2.

Ускорение апоптоза. Ускорение апоптоза доказано при синдроме приобретенного иммунодефицита (СПИД), нейротрофических заболеваниях и некоторых заболеваниях крови, при которых наблюдается дефицит каких-либо форменных элементов. При СПИДе вирус иммунодефицита может активировать CD4 рецептор на неинфицированных Т-лимфоцитах, ускоряя, таким путем, апоптоз, что приводит к истощению клеток данного типа.

Таким образом, апоптоз играет важную роль как в развитии млекопитающих, так и в различных патологических процессах. Функционирование bcl-2 требуется для поддержания жизнеспособности лимфоцитов, меланоцитов, эпителия кишечника и клеток почек во время развития эмбриона; bcl-x необходим для ингибирования смерти клеток в эмбриогенезе, особенно в нервной системе. Bax необходим для апоптоза тимоцитов и поддержания жизнеспособности сперматозоидов во время их развития; р53 является геном супрессии опухолей, поэтому в эмбриогенезе особой роли не играет, но обязательно необходим для супрессии опухолевого роста. Мыши, у которых отсутствовали оба р53 гена, проявляли чрезвычайно высокую склонность к развитию злокачественных опухолей в результате полного или частичного нарушения апоптоза предопухолевых клеток. Усиленный синтез белка, кодируемого bcl-2 геном, приводит к подавлению апоптоза и, соответственно, развитию опухолей; данный феномен обнаружен в клетках В-клеточной фолликулярной лимфомы. При лимфопролиферативных заболеваниях и похожей на системную красную волчанку болезни у мышей наблюдается нарушение функции Fas-лиганда или Fas-рецептора. Повышенный синтез Fas-лиганда может предупреждать отторжение трансплантата. Апоптоз является частью патологического процесса при инфицировании клетки аденовирусами, бакуловирусами, ВИЧ и вирусами гриппа. Ингибирование апоптоза наблюдается при персистировании инфекции, в латентном периоде, а при усиленной репликации аденовирусов, бакуловирусов, возможно герпесвирусов, вируса Эпштейн-Барра и ВИЧ наблюдается активация апоптоза, что способствует широкому распространению вируса. При нейродистрофических заболеваниях отмечается нарушение функции гена (iap-гена), сходного с ингибитором апоптоза бакуловирусов.

Роль апоптоза в защите от онкологических заболеваний. Современная химиотерапия опухолей часто базируется на усилении апоптоза в раковых клетках исходя из того, что они более чувствительны к нему, нежели обычные нераковые клетки. К сожалению, на далеко зашедших стадиях опухолевого процесса апоптоз в раковых клетках, как правило, подавлен. Некоторые интерфероны усиливают экспрессию гена p53, помогая апоптозу. В результате эти интерфероны помогают борьбе с раком. Новое лекарство от рака лёгких гефитиниб ингибирует белок-рецепторную протеинкиназу EGFR-тирозинкиназа (EGFR tyrosine kinase), которая производится в раковых клетках лёгких и запускает каскад реакций, активирующих апоптоз. В результате гефитиниб используется для лечения рака лёгких с минимумом побочных эффектов.