6. Рецепты питательных сред

     

  

6.1. Изотонический раствор - 0,85% раствор хлористого натрия

           

Для приготовления изотонического раствора с рН 6,9-7,0 используют дистиллированную воду рН, которой проверяют индикатором бромтимолбазу, при добавлении которого цвет воды должен быть бутылочно-золотым. В этих случаях воду не используют. Изотонический раствор разливают в пробирки или флаконы в необходимых количествах, стерилизуют при 1 атм. 20 мин.

               

6.2. 0,1%-й водный раствор пептона (пептонная вода)

          

К 1 л дистиллированной воды добавляют 1 г пептона. После размешивания среду кипятят, фильтруют и разливают по пробиркам и флаконам в необходимых количествах, стерилизуют при 1 атм. 30 мин.

               

6.3. Среда для определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов

           

		Сухой питательный агар (ДагНИИПО)	- 35,0 г
	Сухой экстракт кормовых дрожжей			- 2,5 г
	Глюкоза			- 1,0 г
	Вода дистиллированная			- 1000 мл

Довести рН до 7,0, разлить в пробирки по 15 мл, стерилизовать в течение 20 мин при 121 °С (1,1 атм.).

             

6.4. Среда Кесслер с лактозой

           

К 1 л водопроводной воды прибавляют 10 г пептона и 50 мл желчи крупного рогатого скота, кипятят смесь при помешивании 20-30 мин в водяной бане и фильтруют через вату. В полученном фильтрате растворяют 2,5 г лактозы и доводят объем до 1 л, устанавливают реакцию среды (рН 7,4-7,6), после чего добавляют 2 мл 1% водного раствора кристаллического фиолетового, разливают в пробирки по 5,0 мл, 10,0 мл и во флаконы по 50 мл. Готовая среда должна иметь темно-фиолетовый цвет. Среду стерилизуют при 1 атм. 10 мин, предварительно опустив в пробирки поплавки.

                

6.5. Среда КОДА

          

Среду готовят по прописи на этикетке. Разливают по 5 и 10 мл в пробирки без поплавков.

               

6.6. Бульон с лактозой, бычьей желчью и бриллиантовым зеленым ЖЛБ

           

		пептон	- 10 г
	лактоза			- 10 г
	сухая бычья желчь			- 20 г (или 200 мл свежей фильтрованной желчи крупного рогатого скота)
	бриллиантовый зеленый			- 0,0133 г
	дистиллированная вода			- 1000 мл

Растворяют пептон и лактозу в 500 мл дистиллированной воды, добавляют бычью желчь, растворенную в 200 мл воды, смешивают, доводят объем до 950 мл, рН до 7,4. Добавляют 13,3 мл 0,1% водного раствора бриллиантового зеленого, доводят общий объем водой до 1 л. Разливают в пробирки с поплавками по 10 мл. Стерилизуют 15 мин при 121 °С.

                

6.7. ЕС-бульон (для подтверждающего посева на E. coli (по методу НВЧ)*

_____________________

* - пропись ФАО/ВОЗ в модификации Института питания АМН СССР.

		Сухой панкреатический гидролизат казеина	- 20,0 г (или 10-кратное количество жидкого ПГК) с содержанием ок. 500 мг % аминного азота)
	Желчь крупного рогатого скота жидкая				- 15-16 мл
	лактоза				- 5 г
	К НРО				- 4,0 г
	КН РО				- 1,5 г
	NaCl				- 5,0 г
	дистиллированная вода				- 1000,0 мл

Растворяют ингредиенты, доводят рН до 6,9, разливают по 15 мл в пробирки с поплавками, стерилизуют в течение 15 мин при 121 °С.

            

6.8. Среда Гисса с глюкозой

           

На 1 л дистиллированной воды берется 10 г пептона, 5 г хлористого натрия, 2,5 г глюкозы. В дистиллированную воду вначале добавляют пептон, хлористый натрий и кипятят до растворения ингредиентов, затем добавляют 10 мл реактива Андреде, устанавливают рН 7,2-7,4, добавляют углевод и фильтруют. Среду разливают в стерильные пробирки с поплавками по 2-3 мл. Стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин.

Приготовление индикатора Андреде

Фукоин кислый в количестве 1 г растворяют в 200 мл дистиллированной воды, добавляют 32 мл нормального раствора едкого натра. Полученную смесь настаивают в течение 3 суток при комнатной температуре или в течение суток при 37 °С, после чего фильтруют. Реактив хранят во флаконе с притертой пробкой.

             

6.9. Среды Эндо, Левина

           

Среды Эндо, Левина (эозинметиленовоголубой агар) выпускаются в сухом виде Дагестанским НИИ питательных сред, их следует готовить согласно прописям на этикетках банок. Изготовленные и разлитые в стерильные чашки Петри среды можно хранить при температуре 4 °С±1 °С до 10 суток.

           

6.10. Среда для определения индолообразования

           

		Сухой панкреатический гидролизат казеина	- 10,0 г
	NаCl				- 5,0 г
	Д(…..)* -триптофан				- 1,0 г
	Дистиллированная вода				- 1000 мл

_________________

* Брак оригинала. Примечание "КОДЕКС".

Довести рН до 7,0, разлить в пробирки по 5 мл, стерилизовать 15 мин при 121 °С.

Реактив на индол

пара-диметиламинобензальдегид - 5,0 г

соляная кислота концентрированная - 25,0 мл

изоамиловый спирт - 75,0 мл

               

6.11. Бульон на переваре Хоттингера для определения индолообразования

           

В случае отсутствия среды 6.10. используется для теста на индол.

Для приготовления бульона основной перевар Хоттингера разводят дистиллированной водой (или водопроводной) до содержания аминного азота 120-130 мг%, добавляют хлористый натрий в концентрации, 5%, фосфорнокислый двузамещенный калий (К НРО ) - 0,1%. Устанавливают рН 7,4-7,6 и кипятят 15-20 минут. Приготовленный бульон фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки по 5-8 мл. Стерилизуют при 1 атм. 20 мин.

Индикаторная бумажка на индол

		Спирт этиловый 96°	- 50 мл
	Парадиметиаминобензальдегид			- 2,5-3 г
	Фосфорная кислота (конц.)			- 10 мл

Добавленные в спирт ингредиенты смешать до полного растворения. Полученной желтоватой жидкостью смочить край, приблизительно на 1/3, полоски фильтровальной бумаги. Цвет смоченного конца полоски бумаги должен быть желтым. При образовании индола изучаемой культурой цвет бумажки меняется от сиренево-розового до интенсивно-малинового.

                

6.12. Среда Кларка

           

Пептон - 5-7 г

Глюкоза - 5 г

К НРО  - 5 г

дистиллированная вода - 1000 мл

Растворить ингредиенты, довести рН до 6,9 и профильтровать, стерилизовать 20 мин при 115 °С.

              

6.13. Раствор метилового красного для теста с метил-рот

           

Растворить 0,1 г метилового красного в 300 мл 90% этилового спирта. Развести до 500 мл стерильной водой, хранить при +4 °С

             

6.14. Реактивы для реакции Фогеса-Проскауэра

5% альфа-нафтол: растворить 5,0 г альфа-нафтола в 100 мл абсолютного этилового спирта. Хранить при +4 °С.

40% КОН. Растворить 40 г гранул КОН приблизительно в 60 мл дистиллированной воды. Разбавить до 100 мл дистиллированной водой. Хранить при +4 °С.

           

6.15. Цитратная среда Козера

           

		Na(NH )HPO	- 1,5
	К НРО			- 1,0 г
	магния сульфат			- 0,2 г
	натрия цитрат трехзамещенный			- 3,0 г
	дистиллированная вода			- 1000 мл

Растворить ингредиенты в 950 мл дистиллированной воды, добавить 10 мл 0,5% спиртового раствора бромтимолового синего. Установить рН 6,8, проверяя значение рН на потенциометре. Довести объем дистиллированной водой до 1 л. Разлить в пробирки по 10 мл, стерилизовать в течение 15 мин при 121 °С.

               

6.16. Среда Симмонса

           

Среда готовится аналогично среде Козера (6.15.), но после измерения рН в нее добавляют 20 г±0,1 г агар-агара на 1 л, прогревают на водяной бане до растапливания агара, стерилизуют в течение 15 мин при 121 °С. Разливают в стерильные чашки Петри или пробирки.

            

6.17. Среда Ресселя с мочевиной из сухих питательных сред

           

К 100 мл горячей стерильной дистиллированной воды добавляют 4 г сухого препарата с индикатором ВР и лактозой, 0,1 г глюкозы и 1 г мочевины. Полученную среду разливают в стерильные пробирки по 5-6 мл и стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин или текучим паром 2 дня подряд по 15-20 мин.

               

6.18. Трехсахарный агар с мочевиной по Олькеницкому

           

К 100 мл стерильного питательного агара добавляют 1 г лактозы, 0,02 г соли Мора, 0,03 г гипосульфита, 1 г сахарозы, 0,1 г глюкозы, 1 г мочевины и 0,4% раствора фенолового красного 0,4 мл. Предварительно растворяют соль Мора с гипосульфатом в одной пробирке с небольшим количеством воды, а в другой мочевину с углеводами. После растворения все смешивают с агаром и фильтруют через стерильную марлю. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 20 мин. Горячую среду скашивают в пробирках. Незасеянная среда имеет бледно-розовый цвет.

               

6.19. Солевой бульон

           

К 100 мл МПБ с рН 7,0 добавляют 6,5 г хлористого натрия. Разливают в пробирки по 5,0 мл и стерилизуют при 1 атм. 20 мин.

              

6.20. Сахарный бульон

           

К 100 мл стерильного бульона Хоттингера с рН 7,2-7,4 и содержанием 130-150 мг% аминного азота добавляют глюкозу в количестве 1,0 г. После растворения среду разливают в пробирки по 5,0 мл и стерилизуют при 0,5 атм. в течение 20 мин.

             

6.21. Стерильное молоко

           

Стерильное молоко готовят из обезжиренного молока (кислотность 16-18 °Т), которое разливают в пробирки по 10 мл. Стерилизуют при 0,75 атм. 15 мин. Обезжиренное молоко получают путем центрифугирования или кипячения с последующим отстаиванием в цилиндре в холодильнике в течение 2 дней.

               

6.22. Молочно-солевой агар

           

К 100 мл расплавленного и остуженного до 45 °С 2% питательного агара с концентрацией 6,5% хлористого натрия добавляют в количестве 10 мл стерильное обезжиренное молоко. Среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам.

               

6.23. Желточно-солевой агар

           

Желточно-солевой агар может быть приготовлен на основе сухого питательного агара, мясо-пептонного бульона или бульона Хоттингера.

При использовании МПБ к последнему добавляют 2% агар-агара и 6,5% хлористого натрия. При использовании бульона Хоттингера содержание аминного азота в нем должно составлять 150 мг%, для получения солевого агара добавляют 2% агар-агара и 6,5% хлористого натрия.

В случае использования сухого питательного агара к последнему добавляют 6,5% хлористого натрия.

Солевой агар разливают во флаконы по 200 мл и стерилизуют при 1 атм. 30 мин.

Приготовление рабочего раствора желтка

На дно стерильной чашки помещают яйцо, которое тщательно протирают ватой, смоченной спиртом. Пинцетом пробивают, с двух противоположных сторон яйца, два отверстия. Через одно из этих отверстий из яйца полностью удаляют белок, а затем, несколько увеличив отверстие, выливают желток в стерильную банку с 5-6 бусинами. К желтку постепенно добавляют, частями по 20-30 мл стерильного изотонического раствора NаCl, затем содержимое тщательно встряхивают.

Приготовление чашек

На 100 мл расплавленного и остуженного до 45 °С солевого агара добавляют 20 мл рабочего раствора желтка. После полного размешивания агар в условиях бокса разливают в чашки по 15-17 мл. Чашки можно хранить в холодильнике до 1,5-2 недель.

               

6.24. Молочный агар

           

К 100 мл 2% расплавленного и остуженного до 45 °С питательного агара добавляют 10 мл стерильного снятого молока. После тщательного перемешивания агар выливают в чашки по 12-15 мл.

           

6.25. Цитратная плазма кролика

           

Цитратная плазма кролика для реакции плазмокоагуляции выпускается в сухом виде. Готовят непосредственно перед употреблением согласно прописи в прилагаемом наставлении.

              

6.26. Среда для определения реакции окисления маннита в анаэробных условиях

           

Среду готовят из сухого препарата с индикатором ВР и маннитом по прописи на этикетке. Среду разливают в пробирки по 12-15 мл.

             

6.27. Среда Плоскирева из сухих питательных сред

           

Среду готовят по прописи на этикетке.

               

6.28. Висмут-сульфит агар (среда Вильсон-Блера)

           

Среду готовят по прописи на этикетке. Изготовленную и разлитую в стерильные чашки Петри среду можно хранить в холодильнике при +4 °С до 10 суток.

               

6.29. Среда для определения ферментации мальтозы

           

Среду готовят из сухого препарата с индикатором ВР и мальтозой по прописи на этикетке. Среду разливают в пробирки по 2-3 мл.