2 Основные методы использования биотехнологии в селекции растений

Применительно к селекционному процессу, существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro условно можно разделить на две группы.

Первая группа – это вспомогательные технологии. Они не подменяют обычную селекцию, а служат ей. Прежде всего это касается отдаленной гибридизации. К ним можно отнести: оплодотворение in vitro, эмбриокультуру, культивирование семяпочек и незрелых гибридных зародышей, получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор, хранение и криосохранение изолированных клеток, тканей и органов, клональное микроразмножение отдаленных гибридов.

Вторая группа методов – это самостоятельное, независимое от традиционных методов селекции, получение новых форм и сортов растений: клеточная селекция с использованием каллусной ткани, соматическая гибридизация (слияние изолированных протопластов и получение неполовых гибридов), сомаклональная изменчивость, применение методов генной инженерии.

2.1 Вспомогательные для селекции технологии

- Оплодотворение  in vitro (преодоление прогамной несовместимости) (оплодотворение в пробирке).

Проводится в том случае, когда невозможно выполнить оплодотворение между выбранными парами в естественных условиях. Это вызвано несколькими причинами: 1) физиологическими (несоответствие во времени созревания пыльцы и т. д.); 2) морфологическими (короткая пыльцевая трубка или блокирование роста ее на раз­ных этапах развития и т. д.).

Оплодотворение in vitro можно выполнить 2 способами:

1. культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой;

2. завязь вскрывается и на питатель­ную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца. Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro или нет, можно по быстрому росту размеров семяпочек. Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению.

Плацентарное оплодотворение in vitro позволило преодолеть несовместимость в скре­щивании сортов культурного табака N. tabacum с дикими видами N. rosulata и N. debneyi и сделало возможным получение межвидовых гибридов табака в опытах М.Ф. Терновского и др. (1976), Шинкаревой (1986).

Способ применяют только для травянистых растений.

- Культивирование семяпочек и незрелых гибридных зародышей (преодоление постгамной несовместимости).

Постгамная несовместимость при отдаленной гибридизации возникает после оплодотворения. Часто при этом образуются щуплые невсхожие семена. Причиной может быть расхождение во времени развития зародыша и эндосперма. Из-за слабого развития эндосперма зародыш бывает неспособен к нормальному прорастанию. В таких случаях из зрелой щуплой зерновки изолируют зародыш и выращивают его в питательной среде.

- Эмбриокультура (культура изолированных зародышей) - выращивание зародышей на (в) искусственной питательной среде. Применяют в основном при отдаленных скрещиваниях, либо для получения растений из семян с длительным периодом покоя.

Например,

1) показана возможность увеличения выхода пшенично-ржаных гибридов путем доращивания незрелых зародышей, а также использования эмбриокультуры для преодоления постгамной несовместимости при гибридизации пшеницы с колосняком.

2) Для лука разработаны приемы выращивания in vitro абортивных зародышей от гибридных семян с разных этапов эмбриогенеза, выращивание зародышей от частично фертильных межвидовых гибридов.

3) Культура изолированных зародышей используется в селекции томатов и других овощных растений.

4) Способ широко культивируют за рубежом для древесных (дуба, тополя, осины, ели, сосны). Так, в Канаде (Онтарио) ежегодно на лесокультурную площадь высаживают более 60 млн. саженцев ели черной, выращенной из изолированных зародышей в стерильных условиях.

- Получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор.

Гаплоидом (или моноплоидом) называют организм, имеющий в соматических клетках гаплоидный набор негомологичных хромосом.

Гаплоиды и дигаплоиды (на их основе) имеют ряд преимуществ в селекционной работе:

• гаплоидные растения имеют один набор хромосом, характерный для гамет, что дает селекционерам возможность наблюдать мутации сразу же в ходе осмотра гаплоидных растений, поскольку все рецессивные генные мутации в гаплоидных организмах не маскируются доминантными аллелями. После использования мутагенеза определяют в гаплоидах рецессивные мутации и затем получают стабильные линии с ценными мутантными признаками.

• В гаплоидных клетках и растениях гораздо быстрее обнаруживаются редкие рекомбинации генов, а также экспрессия введенного извне генетического материала, которые в обычных диплоидных растениях проявляются только во втором поколении при расщеплении. Это позволяет в 2-3 раза ускорить процесс создания сорта. Это свойство используют для получения новых гаплоидов для селекции путем перевода гаплоидов в культуру гаплоидных протопластов и клеток и последующего использования мутагенеза, генноинженерных манипуляций и клеточной селекции. После регенерации и удвоения числа хромосом гаплоиды с ценными свойствами превращают в фертильное гомозиготное диплоидное растение.

• если гаплоидные клетки подвергнуть полиплоидизации с помощью колхицина, то возникнут дигаплоиды, характеризующиеся абсолютной гомозиготностью. Скрещивание гомозиготных линий дает, как правило, высокопродуктивное потомство (гетерозисные гибриды). С другой стороны, в настоящее время картофель не размножают семенами из-за пестроты потомства, а создание с помощью гаплоидов гомозиготных линий устранит этот недостаток; Изогенные линии на основе удвоенных гаплоидов можно создавать в течение года, тогда как традиционный метод инбридинга требует для этого 4-6 лет.

• У перекрестноопыляющихся растений в результате удвоения числа хромосом гаплоидов получают чистые линии, имеющие самостоятельную ценность. Так, получены линии кукурузы, отличающиеся высокой стабильностью, пониженной инбредной депрессией, значительной общей и специфической комбинационной способностью.

• В результате гибридизации гаплоидов с диплоидными видами получают:

а. моногаплоиды, в которых происходит утрата некоторых хромосом, что используется в моносомном генетическом анализе

б. гетерозисные триплоидные формы.

• Гаплоиды используются для получения карликовых и других необычных форм декоративных растений.

• Гаплоидия применяется также и при отдаленной гибридизации.

Например, культурный картофель, являющийся тетраплоидом - 2п=48, плохо скрещивается с дикими диплоидными видами. После отбора диплоидные гибридные формы вновь переводят на тетраплоидный уровень.

• гомозиготные растения используются селекционерами и в других целях: количественный генетический анализ, изучение взаимодействия генов, изучение генетической изменчивости, определение групп сцепления, установление числа генов, действующих на количественные признаки, определение локализации полигенов и т.д.

• гаплоидные растения (поскольку они смогли регенерировать) лишены летальных или сублетальных мутаций, ведущих к гибели или ослаблению потомства.

Применение методов экспериментальной гаплоидии значительно упрощает и в 2-3 раза сокращает процесс получения стабильных гибридов по сравнению с традиционными методами.

В настоящее время для получения гаплоидов наиболее часто в клеточной инженерии и в селекции растений применяют индуцированный андрогенез в культуре пыльников и пыльцы.

Из микроспор при культивировании пыльников ин витро получены гаплоидные растения более чем у 200 видов, в том числе у пшеницы, ячменя, ржи, риса, картофеля и других культур (они преимущественно относятся к семействам пасленовых, злаковых, крестоцветных).

Наибольших успехов в этом достигли селекционеры Китая, где созданы новые высокоурожайные и устойчивые сорта риса и пшеницы, уже занимающие большие посевные площади: рис- 170000 га и пшеница- 70000 га. В нашей стране также созданы тысячи исходных линий риса, табака, картофеля.

- Клональное микроразмножение отдаленных гибридов.

Микроклональное размножение (= клональное микроразмножение) – 1) размножение растений in vitro (в пробирке); 2) получение in vitro, неполовым путем, генетически идентичных исходному экземпляру растений.

В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность. Термин "клон" был предложен в 1903 году Уэбстером (от греческого klon – черенок или побег, пригодный для размножения растений).

Клон – 1. Группа генетически идентичных клеток или организмов, происходящих из одной единственной предковой клетки или организма [3].

2. Организм или популяция клеток, образованные в результате бесполого размножения одной предковой клетки или группы наследственно идентичных клеток, однако генетическая однородность этих клеток является относительной вследствие спонтанного мутационного процесса [4].

3. Клон – культура, возникшая из одной клетки.

В соответствии с научной терминологией, клонирование подразумевает получение идентичных организмов из единичных клеток.

Метод микроклонального размножения имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения, а именно:

• получение генетически однородного посадочного материала (*эта однородность относительная, очень часто получаются химерные организмы, у которых клетки имеют разную плоидность);

• освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры (*не всегда удается освободиться полностью от вирусов);

• высокий коэффициент размножения (теоретически: 10⁵ – 10⁶ – для травянистых, цветочных растений, 10⁴ – 10⁵ – для кустарниковых древесных растений и 10⁴ – для хвойных);

• сокращение продолжительности селекционного процесса;

• ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;

• размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;

• возможность проведения работ на протяжении в течение всего года;

• возможность автоматизации процесса выращивания.

Методы клонального микроразмножения

Существует много методов клонального микроразмножения, а также различных их классификаций. Н. В. Катаева и Р. Г. Бутенко (1983) выделяют два принципиально различных типа клонального микроразмножения:

1 Получение растений в результате активации уже существующих меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля).

2 Индукция возникновения почек или эмбриоидов de novo:

а) индукция органогенеза:

а1)образование адвентивных побегов непосредственно тканями экспланта;

а2) дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани;

б) индукция соматического эмбриогенеза.

Микроклональное размножение и оздоровление растений

Известно, что успех клонального микроразмножения зависит от меристематического экспланта, его размера и строения. При этом отмечается закономерность: чем больше листовых зачатков и тканей, тем легче идут процессы морфогенеза, которые заканчиваются образованием целого растения. Вместе с тем, при таком развитии конуса нарастания увеличивается риск быстрого транспорта вируса по проводящей системе. Кроме того, даже небольшой меристематический эксплант может содержать вирусы, проникшие в клетки в результате медленного проникновения через плазмодесмы.

В целом, эффективность применения апикальной меристемы в качестве метода оздоровления зараженных вирусами растений может оказаться довольно низкой. Снизить риск попадания вирусов в здоровые ткани можно путем применения предварительной термо- или химиотерапии исходных растений.

- Хранение и криосохранение изолированных клеток, тканей и органов.