2.1. Метод виділення вірусу

Сутність методу полягає у виявленні патогенної дії вірусу на ембріони курей, його гемаглютинуючих властивостях с послідуючою ідентифікацією серологічним методом, визначенні титру та вірулентності виділеного вірусу.

Матеріали та обладнання: термостат з температурою 37‑38 ^оС; центрифуга лабораторна з частотою обертів 3000 об/хв.; стакани центрифужні ємкістю 50 та 100 см³; ваги лабораторні з похибкою не більше 0,01 г; подрібнювач тканин; овоскоп; колби конічні скляні ємкістю 10, 15 та 20 см³; піпетки пастерівські або піпетки скляні вимірювальні ємкістю 1, 2, 5 і 10 см³; ступка порцелянова; шприци з голками; скло кварцове; натрій хлористий 0,87 %‑вий розчин (фізіологічний) з рН 7,2‑7,4; натрію гідроокис 3 % вий розчин або інші дезінфікуючі розчини; натрій лимонно трьохзаміщений 5 %‑вий розчин; йод 5 %‑вий розчин; антибіотики (пеніцилін, стрептоміцин, неовітін); парафін; ембріони курей 9‑10‑добового віку; еритроцити курей у фізіологічному розчині, 1 %‑ва суспензія, яку готують наступним чином: кров беруть у птиці або курей у віці старше 6 міс з підкрильцевої вени в колбу з фізіологічним розчином лимоннокислого натрію. Отриману кров відмивають фізіологічним розчином, піддають центрифугуванню з частотою обертання 1500 об / хв упродовж 10 хв. З осаду відмитих еритроцитів готують 1 %‑ву суспензію на фізіологічному розчині і зберігають не більше 5 діб за температури 4 °С.

Підготовка до дослідження. Проби патологічного матеріалу достають з гліцеринового розчину, трикратно ополіскуючи стерильним фізіологічним розчином і гомогенізують у стерильному фізіологічному розчині в співвідношенні 1 : 5 за допомогою подрібнювача тканин або подрібнюють у ступці з кварцовим склом, центрифугують з частотою обертів 1500‑2000 об / хв упродовж 20 хв.

Супернатант відбирають піпеткою і обробляють упродовж 30 хв за кімнатної температурі антибіотиками: 1000‑2000 ОД / см³ пеніциліну в 500‑1000 ОД / см³ стрептоміцину для придушення сторонньої мікрофлори.

Проведення дослідження. Супернатант досліджують у крапельній реакції гемаглютинації з 1 %‑вою суспензією еритроцитів курей.

Для дослідження однієї проби матеріалу заражають не менше 10 ембріонів 9‑10‑добового віку. Контролем служать 3‑5 незаражених ембріонів.

Перед зараженням ембріони попередньо овоскопують, відзначаючи межу пуги. Збоку ембріона між кровоносними судинами відзначають ділянку для проколу шкарлупи і інокуляції дослідного матеріалу. Шкарлупу з боку пуги і місце проколу дезінфікують і обробляють фламбуванням. У центрі повітряного простору і в місці введення матеріалу роблять пробійником отвори, потім через бічний отвір вводять 0,2 см³ дослідного матеріалу на глибину 2‑3 мм в алантоїсну порожнину. Після зараження ембріонів отвори в шкаралупі заливають парафіном. Заражені і контрольні ембріони інкубують в термостаті упродовж 120 год за температури37 °С.

У процесі інкубація ембріони овоскопують два рази на добу через 12 год. Ембріони, загиблі упродовж перших 24 год, знищують, інші зберігають в холодильнику за температури 4 °С.

Через 72 год інкубації п'ять ембріонів охолоджують за температури4 °С упродовж 12‑18 год, решту ‑ п'ять інкубують до 120 год, а потім охолоджують за 4 ^оС упродовж 16‑18 год.

Перед оглядом ембріонів шкарлупу над повітряним простором дезінфікують 5 %‑вим розчином йоду або фламбують, скривають і збирають ембріональну (алантоїсно-амніотичну) рідину в стерильні пробірки від кожного ембріона окремо. Велогенні штами вірусу вбивають курячі ембріони через 32‑60 год інкубації, мезогенні ‑ через 60‑90 год, лентогенні- через 100 год і більше.

Взяті з кожного ембріона зразки екстраембріональної рідини перевіряють на гемаглютинуючих активність вірусу в крапельної реакції гемаглютинації (РГА), яку ставлять на склі шляхом змішування краплі екстраембріональної рідини з краплею 1 %‑вої суспензії еритроцитів курей.

За відсутності РГА ембріональну рідину відібрану в кількості 1 см³ від кожного зараженого ембріона (не менше 5), об'єднують та повторно заражають курячі ембріони 9‑10‑добового віку (не менше 10 ембріонів).

Виділення вірусу проводять упродовж 3‑5 пасажів на курячих ембріонах, перевіряючи в кожному пасажі ембріональну рідину на наявність гемаглютиніну в крапельній РГА. Якщо титри гемаглютинінів низькі, проводять ще 2‑3 додаткових пасажу.

Обробка результатів. Пробу дослідного матеріалу вважають негативною, якщо у всіх проведених пасажах не буде виявлено гемаглютинації еритроцитів і патогенної дії вірусу (загибель ембріонів).

За наявності гемаглютинації еритроцитів або загибелі ембріонів проводять ідентифікацію виділеного вірусу, визначають титр і вірулентність вірусу на ембріонах курей.