2.4. Метод титрування вірусу

Сутність методу полягає у визначенні титру вірусу на ембріонах курей.

Для проведення дослідження застосовують додаткові матеріали: ембріони курей 9‑10‑добового віку від птиці, вакцинованої вакциною з групи лентогенних штамів не менше ніж за 3 міс до збору інкубаційних яєць.

Підготовка до дослідження. Готують 10-кратні розведення вірусу наступним чином: у 10 стерильних пробірок наливають по 9 см³ стерильного фізіологічного розчину. Потім в першу пробірку вносять 1 см³ вірусу ‑ отримують розведення 10^-1. Потім новою піпеткою після 3-разового перемішування вмісту в першій пробірці відбирають 1 см³ і переносять у другу пробірку. Так готують і наступні розведення до 10^-1 включно, використовуючи при цьому на кожне розведення, окрему градуйовану піпетку.

Проведення дослідження. Приготованими 10-кратними розведеннями вірусу інокулюють по п'ять курячих ембріонів у дозі 0,1 см³ і інкубують упродовж 144 год. Овоскопію проводять кожні 12 год, при цьому ембріони, загиблі в перші 24 год, не враховуються.

Через 144 год інкубації всі ембріони охолоджують за 4 ^оС упродовж 16‑18 год і з ембріональною рідиною заражених ембріонів ставлять РГА.

З ембріонів (що загинули і вижили) беруть до уваги тільки ті, які дали позитивну РГА.

Обробка результатів. Обчислення ЛД₅₀ для курячих ембріонів проводять по метолу Ріда і Менча.

2.5. Метод визначення вірулентності вірусу

Сутність методу полягає у визначенні вірулентності вірусу для курячих ембріонів.

Проведення дослідження. Типування вірусу проводиться визначенням середнього часу загибелі 9‑10‑добових курячих ембріонів, викликаної мінімальної летальною дозою.

Для проведення дослідження використовують розведення 10^-1, 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10.

Кожним з цих розведень інокулюють по п'ять ембріонів 9‑10‑добового віку в алантоїсну порожнину в двох повторностях з розривом у зараженні 12 год, тобто заражають в 8 годин ранку по п'ять ембріонів, кожним із зазначених розведень та у 20 годин ці ми ж розведеними знову по п'ять ембріонів. Заражені ембріони овоскопують щодня через 8 год: у 8 годин ранку та 16 годин, реєструючи час загибелі кожного ембріона упродовж 12 год.

Обробка результатів. Мінімальною летальною дозою (МЛД) вважають найбільше розведення, що викликає загибель всіх інокульованих ембріонів. Середній час загибелі (СЧЗ) обчислюють діленням суми годин загибелі всіх ембріонів, викликаних мінімальною летальною дозою, на число ембріонів. У велогенних штамів середній час загибелі (СЧЗ) становить до 60 год, у мезогенних штамів - від 60 до 90 год, у лентогенних штамів - понад 100 год.

2.6. Метод визначення специфічних антитіл

Сутність методу полягає у виявленні специфічної здатності антитіл сироватки крові хворої і перехворілої птиці пригнічувати гемаглютинуючу дію вірусу в реакції затримки гемаглютинації (РЗГА).

Для проведення дослідження застосовують додаткові реактиви: гліцерин; лід сухий; калій йоднокіслий.

Підготовка до дослідження. Дослідні сироватки для видалення термолабільних інгібіторів прогрівають на водяній бані за 60 °С упродовж 30 хв.

Для видалення термолабільних інгібіторів через розведену і прогріту сироватку пропускають вуглекислий газ з апарату Киппа або додають шматочки сухого льоду. Обробку сироватки проводять упродовж 2‑3 хв. Осад, що утворився видаляють центрифугуванням з частотою обертів 1500 об / хв упродовж 10 хв.

Допускається обробляти сироватки розчином йоднокислого калію. Для обробки сироватки 0,2 см³ сироватки змішують з 0,6 см³ розчину А (0,256 г КІО₄ в 100 см³ бідистильованій воді) та інкубують на водяній бані упродовж 15 хв за 18‑20 °С. Після цього додають 0,6 см³ розчину Б (1 см³ гліцерину в 100 см³ фізіологічного розчину), а також 0,2 см³ фізіологічного розчину. Отриману суміш кілька разів струшують і використовують в якості основного розведення сироватки ⅛ для дослідження.

Проведення дослідження. Готують дворазові розведення сироватки на фізіологічному розчині від 1 : 2 до 1 : 1024. Та проводять РЗГА.

Для постановки реакції РЗГА допускається використовувати мікротитратор Такачі. При цьому вона проводиться аналогічним чином у панелях з лунками в об’ємі 0,025 і 0,050 см³.

Облік реакції проводять через 30 хв після осідання еритроцитів у контролі.

Обробка результатів. Титром сироватки вважають останне її розведення, яке дає повну затримку гемаглютинації з заздалегідь відомим антигеном.

Виявлення титрів 1 : 4 і вище в окремих екземплярів птиці дає підставу для проведення вірусологічних досліджень, тобто виділення та ідентифікації вірусу.

Виділений і типізований зі специфічними сироватками вірус служить підставою для постановки діагнозу.