52. Реакция связывания комплемента Цель:

серодиагностика: определение Ат в сыворотке пациента;

сероидентификация: определение Аг(исследуемый материал).

Сущность - используется две конкурирующие системы Аг и Ат и один комплемент.

Реакция связывания комплемента

1 система – основная (исследуемая или тест-система): Серодиагностика: сыворотка больного (Ат) + антиген + комплемент (реакция связывания комплемента).

Сероидентификация: исследуемый материал, содержащий Аг (моча, ликвор, носоглоточный смыв и др.) + диагностическая сыворотка (известные Ат) + комплемент (реакция связывания комплемента).

2 система - индикаторная или гемолитическая: выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы: эритроциты барана и антиглобулиновая кроличья сыворотка - свободный комплемент вызывает гемолиз. При отсутствии свободного комплемента (связывание с 1 системой) – задержка гемолиза.

Реакция Вассермана

 Цель: серодиагностика сифилиса

51. РЕАКЦИИ ИММУННОГО ЛИЗИСА: В основе реакции лежит способность специфических антител образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе с эритроцитами, бактериями, что приводит к активации системы комплемента по классическому пути и лизису клеток. Из реакций иммунного лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и редко - реакция бактериолиза (главным образом при дифференциации Холерных и холероподобных вибрионов).

 Реакция гемолиза (Ag – эритроцит);

 Реакция бактериолиза (Ag – бактерии);

 Реакция цитолиза (Ag – клетка).

РЕАКЦИЯ ГЕМОЛИЗА

 Цель:

 Для определения титра и активности системы

комплемента (радиального гемолиза).

 Как индикатор для оценки РСК.

 Компоненты (ингредиенты) – Аг (эритроциты барана) + Ат (гемолитическая сыворотка крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана) + комплемент (сыворотка крови морской свинки).

Титрование комплемента.Для этого свежую сыворотку морской свинки разводят изотоническим раствором хлорида натрия от 1:10 до 1:40 (табл. 18). К 0,2 мл каждого разведения комплемента добавляют по 0,4 мл гемолитической системы (смеси равных объемов 3 % суспензии эритроцитов в (изотоническом растворе хлорида натрия и гемолитической сыворотки в разведении, соответствующем ее тройному титру). Пробирки выдерживают при 37°С и через 30 мин

титр комплемента—наибольшее разведение комплемента, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки.

Рабочая доза комплемента должна быть выше титра на 25%.

50.  комплемент является компонен­том многих иммунологических реакций, направ­ленных на освобождение организма от микробов и других чужеродных клеток и антигенов .

Свойста:

а) участвует в лизисе микробных и других клеток (цитотоксическое действие);

б) обладает хемотаксической активностью;

в) принимает учас­тие в анафилаксии;

г) участвует в фагоцитозе. 

Пути активации

По классическому пути комплемент активирует­ся комплексом антиген-антитело. Для этого достаточно участия в связывании антигена одной молекулы IgM или двух молекул IgG. Процесс начинается с присоединения к ком­плексу АГ+АТ компонента С1, который рас­падается на субъединицы C1q, C1r и С1s. Далее в реакции участвуют последовательно активированные «ранние» компоненты комплемента в такой последовательности: С4, С2, СЗ. когда одна молекула пре­дыдущего компонента активирует несколько молекул последующего. «Ранний» компонент комплемента С3 активирует компонент С5, который обладает свойством прикрепляться к мембране клетки. На компоненте С5 путем последовательного присоединения «поздних» компонентов С6, С7, С8, С9 образуется литический или мембраноатакующий комплекс который нарушает целостность мембраны (образует в ней отверстие), и клетка погибает в результате осмотического лизиса.

Альтернативный путь активации комплемен­та проходит без участия антител. Этот путь характерен для защиты от грамотрицательных микробов. Каскадная цепная реакция при аль­тернативном пути начинается с взаимодействия антигена (например, полисахарида) с протеи­нами В, D и пропердином (Р) с последующей активацией компонента СЗ. Далее реакция идет так же, как и при классическом пути — образу­ется мембраноатакующий комплекс.

Лектиновый путь активации комплемента также происходит без участия антител. Он ини­циируется особым маннозосвязывающим белком сыворотки крови, который после взаимодейс­твия с остатками маннозы на поверхности мик­робных клеток катализирует С4. Дальнейший каскад реакций сходен с классическим путем.

49.РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ:

сущность :осаждение (преципитация) антигена, находящегося в коллоидном состоянии, под воздействием специфических антител в растворе электролита.

применение

1. диагностика инфекционных заболеваний

2. судебная-медицинская экспертиза

*определение видовой принадлежности белков – при анализе кровяных пятен,спермы и т.д.

3. санитарная практика:выявление фальсификации рыбных и мясных изделий.

Цель: сероидентификация.

Преципитоген - антиген

• Преципитин – антитело

Преципитат – иммунный комплекс (осадок), образующийся в результате РП.

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ: по Асколи В пробирке: высокочувствительная (как всякая РП)

Компоненты (ингредиенты) - последовательные разведения антигена экстрагированные из исследуемого материала – шерсти животного) наслаивают на стандартные разведения диагностической преципитирующей сыворотки; титр РП – максимальное разведение антигена, при котором наблюдается кольцо преципитации.

в геле ►преимущество по сравнению с пробирочной - гель, высокоочищенный агар, выполняет функцию локализации преципитата, т.к. он, в отличие от антител и антигенов, не может диффундировать в геле.

простая радиальная иммунодиффузия по Манчини

 Цель - определение класса и концентрации Ig в сыворотке пациентов(сероидентификация).

 Компоненты (ингредиенты) – гель, содержащая антиглобулиновую сыворотку (Ат против Ig человека) и сыворотка пациента (содержащаяIg), которая вносится в лунки.

 Визуально вокруг лунки с исследуемым материалом образуется

преципитат в виде кольца.

двойная, или встречная, иммунодиффузия по Оухтерлони

 Сущность - диффундируют оба компонента реакции,между которыми образуются полосы «усы» преципитации.

Компоненты (ингредиенты) – в центральной лунке сыворотка к Аг, в периферических лунках Аг

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ: иммуноэлектрофорез

 Сущность – электрофоретическое разделение белков (исследуемого материала) в забуференном агаровом геле;

 в канавку (параллельно миграциибелков) вносят преципитирующую сыворотку;

 дуги преципитации дают представление о составе исходнойсмеси антигенов по своему:

 количеству,

 расположению,

*форме

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ:иммуноблотинг

 электрофоретическое разделение антигенов в полиакриламидном геле;

 перенос их на микропористую нитроцеллюлозную мембрану;

 обработка моноклональными антителами;

 выявление преципитатов с помощью меченной антиглобулиновой сыворотки (напр. в РИФ, ИФА)

48.реакции агглютинации

Этапы (стадии)

 СПЕЦИФИЧЕСКАЯ (невидимая) – взаимодействие Аг и АТ, формирование решетки (каркаса)

 НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ (видимая) – выпадение решетки (каркаса) в осадок

способы постановки

1. Прямая реакция агглютинации:

- пластинчатая (ориентировочная)

- объемная (развернутая)

2. Непрямая реакция агглютинации:

 эритроциты – гемагглютинация (РНГА,РОНГА);

 частицы латекса - латекс-агглютинация;

 стафилококки – коагглютинация;

3.На стекле (пластинчатая, ориентировочная) –чаще используется для идентификации антигена

 Компоненты (ингредиенты): чистая культура неизвестного микроба и агглютинирующие диагностические сыворотки (поли- и моновалентные)

4.В пробирке (объемная, развернутая) – чаще используется для обнаружения антител (серодиагностики) и определения их количества (титра);

 Повторение ее через 5-7 дней позволяет выявить нарастание титра антител у больного человека (метод парных сывороток);

 Компоненты (ингредиенты): сыворотка больного и диагностикумы.

47.виды серологических реакций

1. Простые (2-х компонентные: Ag + Ig)

 РА (с корпускулярным антигеном)

 РП (с растворимым антигеном)

2. Сложные (3-х компонентные):

(Ag + Ig + C) – РСК.

3. С использованием метки: РИФ, ИФА,РИА, ИЭМ.

46. Серологические реакции: цели применения

 Серологическая диагностика – определение неизвестных Ат в сыворотке (или других биологических жидкостях) крови больного с помощью известного Аг (диагностикума):

а) неизвестные Ат – это искомые Ат сыворотки крови людей (больных, переболевших, носителей, вакцинированных);

б) диагностикум – это стандартные препараты, которые получают из чистых культур микроорганизмов определенных видов или их Аг. Микроорганизмы выращивают, затем инактивируют, стандартизируют (количество микробов в единице объема); инактивируют нагреванием, обработкой формалином, спиртом, ультразвуком и т.д. (диагностикум теряет патогенность, но сохраняет Аг свойства).

Серологическая идентификация –определение вида неизвестного Аг при помощи известных Ат:

а) неизвестные Аг – это микроорганизмы,токсины, белки крови, клетки разных органов

и тканей другого вида, клетки трансплантантов;

б) известные Ат – это стандартные препараты –иммунные диагностические сыворотки, специфичные определенному (искомому) Аг.

45.

44. Серологические реакции – реакции Аг+Ат,протекающие in vitro

Серология (от лат. serum – сыворотка) ► Раздел иммунологии, изучающий закономерности взаимодействия Аг и Ат сыворотки крови.

характеристика

 Взаимодействие Аг и Ат строго специфично;

 Проходят при эквивалентных соотношениях Аг и Ат;

 Имеют двухфазный характер:

а) специфическое взаимодействие – фаза «невидимая»;

б) образование видимых комплексов (для этого добавляют физ.раствор);

 Проходят по типу физико-химической реакции в коллоидной системе;

 Выделяется небольшое количество тепла(слабоэкзотермичны).

43. Антигены бактерий

Жгутиковый (Н-антиген) локализован в локомоторном аппарате бактерий – жгутиках. Представляет собой белок флагеллин, при нагревании быстро разрушается и теряет свою специфичность. Соматический (О-антиген) связан с клеточной стенкой бактерий. Его основу составляют липополисахариды. Этот антиген термостабилен и не разрушается при кипячении. Капсульный (К-антиген) расположен на поверхности клеточной стенки бактерий, образующих капсулу, имеет гетерополисахаридную или белковую природу. Некоторые из К-антигенов термостабильны, другие – термолабильны.

42. Свойства антител

АФФИННОСТЬ – прочность связи конкретной паратоп/эпитоп; наибольшая -> у моноклональных антител, IgG.

АВИДНОСТЬ – прочность связи молекулы антитела с молекулой антигена в целом; наибольшая ->у IgM

НЕПОЛНЫЕ АНТИТЕЛА

*одновалентные антитела, не образующие видимого глазом гигантского иммунного комплекса в ходе реакций агглютинации или преципитации

* блокирующие антитела, реагины

Процесс взаимодействия антигена и антитела в серологических реакциях протекает в две фазы: