Общая характеристика работы
Работа 30 стр., включающих 9 рис., 49 источников.
СРАВНЕНИЕ ДВУХДОМЕННОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ФРАГМЕНТА АНТИТЕЛА SCFV4D5 И НАНОАНТИТЕЛА 2D3, СПЕЦИФИЧНЫХ К ОНКОГЕНУ C- ERBB2
Объекты исследования: двухдоменный рекомбинантный фрагмент антитела scFv4D5, наноантитело 2D3.
Цель: сравнение структурно функциональных свойств двухдоменного антитела scFv4D5 и наноантитела, специфичных к протоонкогену c-ErbB2.
Методы исследования: микробиологические (культивирование микроорганизмов), генетические (трансформация) и молекулярно-генетические методы (выделение ДНК, клонирование, рестрикционный анализ, экспрессия), физико-химические (хроматография, спектрофотометрия, цитофлюориметрия).
Известно, что минимальным фрагментом антител, сохраняющим нативную структуру активного центра, является одноцепоченое антитело в составе VH и VL доменов – scFv фрагмент. В крови представителей сем. Camelidae (верблюды, ламы, викуньи) кроме классических антител обнаруживаются в значительном количестве особые неканонические антитела с упрощенной структурой. Антиген-узнающий участок этих антител формируется лишь одним вариабельным доменом (VHH), который непосредственно связан через шарнирный район с Fc-доменом. Было проведено прямое сравнение свойств наноантитела с минимальным по размеру функционально активным scFv фрагментом, специфичных к c-ErbB2.
Получены штаммы-продуценты фрагмента scFv4D5 канонического антитела 4D5 и фрагмента однодоменного антитела 2D3. Белки получены экспрессией в бактериальном штамме E.coli BL21(DE3) в составе рекомбинантных плазмид pET-23b(+) для scFv4D5 и pET-22b для VHH домена. Разработаны протоколы экстракции, ренатурации и хроматографической очистки белков, позволяющие получать целевые белки с высокой степенью очистки.
Ключевые слова: SCFV4D5, НАНОАНТИТЕЛО, ОНКОГЕН C-ERBB2, КЛОНИРОВАНИЕ, ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР, ЭКСПРЕССИЯ, ОДНОДОМЕННОЕ АНТИТЕЛО, РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ
Глава 1 обзор литературы
1.1 Антитела
1.1.1 Общая характеристика
Антитела, или иммуноглобулины (Ig), – это растворимые гликопротеины крови и тканевой жидкости, играющие центральную роль в системе гуморального иммунитета у позвоночных. Антитела синтезируются В-лимфоцитами в ответ на чужеродные биологические и химические вещества (антигены) самой разнообразной структуры с целью их нейтрализации. Благодаря высокой специфичности и высокой аффинности связывания с определенным антигеном, а также возможности возникновения антител к практически неограниченному репертуару антигенов, антитела и их производные являются одними из наиболее важных реагентов для использования в фундаментальных, прикладных и медицинских исследованиях[7]. Классические антитела (рис. 1.1)[42;40] представляют собой крупные (~150 кДа – IgG) мультимерные белки, объединяющие две идентичные тяжелые H-цепи (которые, в свою очередь, состоят из вариабельного VH-, трех константных CH1-, CH2-, CH3-доменов и шарнирного участка между CH1- и CH2-доменами) и две идентичные легкие L-цепи (состоящих из вариабельного, VL-, и константного, CL-доменов). Четырехцепочечная молекула объединена посредством нековалентных и ковалентных (дисульфидных) связей между цепями. При помощи протеазы папаина антитела можно расщепить на два фрагмента: Fab (Fragment antigen binding, антиген-связывающий фрагмент) и Fc (Fragment crystalliz able, фрагмент, способный к кристаллизации). Соответственно одна область молекулы антител (Fab) определяет ее антигенную специфичность, а другая (Fc) осуществляет эффекторные функции, которые направлены на элиминацию антигена [38]. Между СН1- и СН2-доменами Н-цепи находится шарнирная область (“hinge region”), от которой зависит подвижность Fab-фрагмента. СН3-домен взаимодействует с Fc-рецептором на поверхности клеток, принимающих участие в иммунологических реакциях. Правильная комбинация вариабельного района тяжелой цепи (VH) и вариабельного района легкой цепи (VL) формирует участок связывания антигена, в то время как константные домены антител непосредственно не участвуют в узнавании антигена [18].
scFv
scFv
Рисунок 1.1 - Схематическое изображение обнаруживаемых традиционных антител и их фрагментов
Минимизированной производной антигенсвязывающего фрагмента классических антител является одноцепочечная конструкция, в которой вариабельные домены тяжелой и легкой цепей соединены линкерной последовательностью(scFv). В 1993 г. группой бельгийских ученых опубликовано важное открытие: кроме классических антител, в крови представителей сем. Camelidae (верблюды, ламы, викуньи) обнаруживаются в значительном количестве особые неканонические антитела с упрощенной структурой [25]. Они состоят из димера только одной укороченной (без СН1-домена) тяжелой цепи, а легкая цепь отсутствует. Антиген-узнающий участок HCAb формируется лишь одним вариабельным доменом (VHH), который непосредственно связан через шарнирный район с Fc-доменом. Позднее подобные неканонические одноцепочечные антитела обнаружены также у некоторых видов акул и родственных им хрящевых рыб – “химер” [39]. Антиген-узнающий вариабельный домен этих антител обозначили как VNAR (в отличие от VHH у представителей Верблюдовых). Часто вместо VHH и VNAR используют термин “nanobody” (нанотело), “однодоменное антитело”, “миниантитело” или “наноантитело”. Нуклеотидную последовательность гена наноантитела можно эффективно клонировать и экспрессировать в бактериях и дрожжах. Получаемое в виде мономера однодоменное наноантитело (с размерами~2.5 нм в диаметре и ~4 нм в высоту и молекулярной массой 12–15 кДа) – наименьший из известных на сегодня белков, обладающих свойством специфически связывать антиген.