2.3 Методы исследования

Трансформация

Трансформирование выполняли с использованием набора реагентов TransformAidTM Bacterial Transformation Kit (Fermentas, Литва) согласно инструкции производителя.

1.150µl ночной культуры поместили в 1,5 ml C-medium среды и культивировали 20 мин. на шейкере при 37 °С

2. центрифугировали 1 минуту, 10 000 g, супернатант удалили

3. ресуспендировали осадок в 75µl T-solution (раствор A+B) и инкубировали 5 минут во льду

4. центрифугировали в микроцентрифуге 1 минуту, супернатант удалили

5. ресуспендировали в 25µl T-solution, инкубировали 5 минут во льду

6. добавили 1µl DNA, 2 минуты выдерживали на льду,

7. добавили 25µl подготовленных клеток и инкубировали во льду 5 минут

8. высев на чашки с твердой питательной средой с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°С

Выполнялась для E.coli штаммов BL21 (DE-3) и JM107, с использованием плазмид pET23d::scFv4D5, pUC57:: Nb2D3, pET-22b::Nb2D3.

Выделение плазмидной ДНК

Для выделения плазмиды отобрали колонии и инокулировали в пробирки, содержащие по 3 мл среды LB с ампициллином (50 мкг/мл), и выращивали при 37оС в течение ночи на шейкере при 180 об/мин. Клетки по достижению оптической плотности около 2 единиц использовали для выделения плазмидной ДНК. Выделение осуществляли при помощи набора реагентов DNA Purification System (Promega, USA) согласно инструкции производителя.

5 миллилитров ночной культуры центрифугировали при 10 000 g 5 минут, супернатант удалили

осадок ресуспендировали в 250 µl Cell Resuspension Solution

добавили 250 µl Cell Lysis Solution, аккуратно перемешали переворачиванием пробирки 4 раза

добавили 350 µl Neutralization Solution, аккуратно перемешали переворачиванием 4 - 6 раз

центрифугировали при 14 000 g, 10 минут

перенесли 850 µl лизата в Spin Column, центрифугировали 1 минуту при комнатной температуре при 14 000 g

добавили 250 µl Column Wash Solution, центрифугировали 1 минуту при 14 000 g (2 раза)

перенесли Spin Column в стерильные микроцентрифужные пробирки

элюировали плазмидную ДНК водой в объеме 50 µl

Выполнялось для плазмид pET23d::scFv4D5, pUC57:: Nb2D3, pET-22b::Nb2D3.

Экспрессия рекомбинантного scFv4D5

Клетки E. coli, штамм BL21(DE-3), трансформированные плазмидой pET23d::scFv4D5 культивировали в 0,25 л LB среды, содержащей ампициллин (100 мг/л), при 37 °С в течение ночи. Культуру разбавили до 3 литров и продолжали культивирование до достижения клетками середины логарифмической фазы роста. После 2-3 ч при достижении культурой плотности 0.6-0.8 ОЕ (измерение проводили при длине волны 600 нм.) в среду добавили ИПТГ до конечной концентрации 50 µМ, и продолжили культивирование еще 4 ч при 30 °С. Затем клетки осадили центрифугированием при 5 000 g в течение 15 мин, ресуспендировали осадок клеток в 80-100 мл 0,1 М Tris-HCl, рН 8,0, дезинтегрировали на френч-прессе (EmultiFlex, Франция) и центрифугировали при 35 000 g в течение 30 мин для осаждения телец включения.

Очистка scFv4D5

Осажденные центрифугированием тельца включения последовательно промывали 20 мМ трис буферным раствором, содержащим мочевину в концентрации 1 М, 2 М и 3 М, с длительностью каждой стадии 1 ч при постоянном перемешивании с последующим центрифугированием при 30 000 g в течение 30 мин. для удаления остатков ДНК и капсульных липополисахаридов бактерии-продуцента. Далее тельца включения растворили в 2 М мочевины, 10 мМ трис-HCl, рН = 8,0; довели рН раствора до 12,0 с помощью 1М NaOH, центрифугировали раствор при 30 000 g, понизили рН супернатанта с помощью 1М HCl до 8,0 и повторно центрифугировали. Далее раствор нанесли на хроматографическую колонку (1,0х5,0 см) с сорбентом Ni-NTA-Sepharose, уравновешенную 10 мМ трис-HCl, рН = 8,0. Колонку промыли десятью объемами 10мМ трис-HCl с добавлением 0.5M NaCl (рН=8.0), затем 10 мМ трис-HCl и 20мМ имидазолом для снятия неспецифически связанных белков. Двухдоменный белок scFv4D5 элюировали при концентрации имидазола 0,20 М в 10мМ трис-HCl буфере. Фракции, содержащие scFv4D5, диализовали против 50 мМ натрий-фосфатного буфера рН 7,4.

Рестрикция плазмидной ДНК

Рестрикцию проводили эндонуклеазами Not I и Nde I (Fermentas, Литва) в течении 16 часов при 37оС согласно следующей прописи:

Not I 2 µl

Nde I 2 µl

Матрица ДНК 8 µl (5 мкг)

Буфер Tango 4 µl

Вода до 40 µl .

Дополнительно проводили дефосфорилирование вектора pET-22b(+) щелочной фосфатазой (CIAP) согласно протоколу «Fermentas» (ThermoFisher). В смесь для рестрикции после инкубации добавили 0,1 U CIAP, 5 мкл. 10Х буфера, воду (nuclease-free grade) до 50 мкл. Смесь инкубировали при 37оС в течение 30 минут. Реакцию инактивировали нагреванием до 85оС в течение 15 минут.

Проведение электрофореза в системе буфера TBE и геля агарозы.

Приготовление буферного раствора ТВЕ на 1000 мл:

0,089 М Трис-борат (10,78г. трис-основания, 5,5 г. борной кислоты), 0,002М ЭДТА (4,38 г. ЭДТА, рН 8,0)

Гель агарозы 1,0 % (1,0 г агарозы на 100 мл буфера ТВЕ).

Раствор агарозы разогревали в микроволновой печи до полного расплавления. Бромистый этидий (1 мг/мл) вносили из матричного раствора в аликвоту расплавленной остывшей до 55°C агарозы до конечной концентрации 0,1-10 мкг/мл. В камеру для горизонтального электрофореза установили ограничители, по швам нанесли агарозу при помощи автоматической пипетки для лучшей герметизации камеры. Установили гребенку и залили остывшую до 40-50°C агарозу. Затем, когда гель полимеризовался, заполнили камеру буфером ТВЕ, извлекли ограничители и разделительную гребенку. Образцы смешали с загрузочным буфером и внесли в лунки агарозного геля. Выставили режим 70V и по перемещению красителя судили о разгонке образцов в геле. После окончания электрофореза гель для визуализации поместили под трансиллюминатор.

Выделение из геля плазмидной ДНК и вставки гена

Полученные электрофоретическим разделением ДНК в геле агарозы (1.5 %) рестрикционный фрагмент 2D3 и вектор pET-22b были выделены и очищены с помощью спин-колонок компании “Promega” согласно протоколу производителя.

Лигирование

Полученный рестрикционный фрагмент 2D3 лигировали с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (“Fermentas”, Литва) в вектор для экспрессии pET-22b(+) согласно следующему протоколу:

Вставка 0,15 pmol

Вектор 0,05 pmol

Буффер10Х 2 µl

Т4 ДНК лигаза 1 µl

Вода до 20 µl

Смесь инкубировали при 37°С в течение 30 минут. Инактивировали действие лигазы десятиминутным прогреванием смеси до 65°С.

Лигазной смесью, содержащую рекомбинантную плазмиду, трансформировали компетентные клетки E.coli BL21(DE3).

Экспрессия наноантитела 2D3

Клетки E. coli, штамм BL21(DE3), трансформированные плазмидами pET-22b (+) со вставкой гена наноантитела, культивировали в 0,25 л LB среды, содержащей ампициллин (100 мг/л), при 37°С в течение ночи. Культуру клеток разбавили свежей питательной средой до 3 литров и продолжали культивирование до достижения клетками середины логарифмической фазы роста. После 2-3 ч инкубации при достижении оптической плотности культуры 0.6-0.8 О.Е. (при длине волны 600 нм.) добавили ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ и растили клеточную культуру 4 ч при 30°С. Затем клетки осаждали центрифугированием при 5 000 g в течение 15 мин, ресуспендировали осадок клеток в 80-100 мл 0,1 М Tris-HCl, (рН=8,0), дезинтегрировали на френч-прессе и центрифугировали при 35 000 g в течение 30 мин для осаждения телец включения.

Осажденные тельца включения трижды промывали 20 мМ трис-HCl буфером (рН=8,0) с последующим центрифугированием при 30 000 g в течение 20 мин. Отмытые тельца включения растворили в 2 М мочевины, 20 мМ трис-HCl (рН=8,0) и довели рН раствора до 12 с помощью 1 М NaOH, центрифугировали раствор при 30 000 g. Далее раствор нейтрализовали с помощью 1 М HCl до рН 8-9 и центрифугировали при 30 000 g.

Очистка наноантитела 2D3

Однодоменный белок 2D3 (pI = 6.9) очистили от примесных белков следующим образом: раствор белка центрифугировали, разбавили в 2 раза 0,5 М аргинином, (рН=9), диализовали против 0,5 М раствора аргинина с рН 9,0 и затем диализовали против 50 мМ натрий фосфатного буфера рН=8,0. Далее белок нанесли на колонку Mono-Q. В несорбированной фракции собрали чистый белок.

Электрофорез в ПААГ

Выполнен согласно протоколу ДСН-ПААГ-электрофореза по Леммли (Laemmli 1970 [23]). Используемая в этом протоколе система с двумя гелями разного состава позволяет получить более высокое разрешение белков различной молекулярной массы.

Аналитическая гель-хроматография

Гель-хроматографию проводили на колонке Superdex 200 (10 х 300 мм, «GE Healthcare») используя в качестве подвижной фазы 50 мМ Na-фосфатный буфер, pH 7,0 при комнатной температуре со скоростью элюции 1 мл/мин. Регистрировали оптическое поглощение элюата при длине волны 214 и 280 нм.

Определение антигенсвязывающих параметров антител методом проточной цитофлуориметрии

Для получения флуоресцентно модифицированных VHH наноантитела и фрагмента scFv4D5 модификатор (флуоресцеин изотиоцианат, ФИТЦ) растворили в диметисульфоксиде (ДМСО) до концентрации 12 мг/мл. Антитела в концентрации 0,8-1,2 мг/мл диализовали против буферного раствора 0,1 М карбоната Na рН 9,4. Раствор ФИТЦ в ДМСО добавляли к раствору антител исходя из молярного соотношения ФИТЦ/белок = 10:1

Для минимизации конкурентного процесса непродуктивного гидролиза изотиоцианильной группы в щелочной среди и большей эффективности реакции модификации раствор ФИТЦ вносили тремя порциями с интервалами в 20 мин, добавляя каждый раз по 5 мкл раствора ФИТЦ при интенсивном перемешивании. Общее время реакции составляло 1 час при комнатной температуре. Раствор с конъюгированным аддуктом ФИТЦ-белок диализовали 2 часа против 0,1 М карбонатного буфера рН 9,4., а затем 20 часов против 0,01 М Na-фосфатного буфера рН 7,4. Степень модификации антител флуоресцеином оценили исходя из количества белковосвязанного красителя, определенного регистрацией спектра поглощения конъюгата с использованием коэффициента молярной экстинкции флуоресцеина 73,0•103 М-1•см-1. Клетки SKBR-3 и MDA-MB-231 растили в среде RPMI-1640 c добавлением фетальной сыворотки в конечной концентрации 10%. Клетки снимали с культуральных планшетов 0,25%-ным раствором трипсин–ЭДТА и суспендировали в холодном 0,01 М фосфатном буфере рН 7,4, содержащем 10% фетальной сыворотки, до концентрации 106 клеток/мл. Флуоресцентно-меченые антитела добавляли до молярного соотношения антитело:рецептор в диапазоне от 20:1 до 500:1, исходя из расчетного количества рецепторов НЕR2/neu, равного 106 1/клетку линии SKBR3. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре суспензию клеток трижды отмывали в охлажденном PBS(Приготовление PBS буфера 1000 мл буфера: КН2РО4 –0.2314 г.; Na2HPO4 – 0,7384 г.; NaCl – 8,77 г.; H2O до 1000 мл.). После чего определили количество антител связанных с рецептором HER2/neu на клетках. Взаимодействие флуоресцентно-меченых антител с клетками с высоким (SKBR-3) и низким (MDA-MB231) уровнем экспрессии HER2/neu определяли методом проточной цитофлуориметрии на приборе Becton Dickinson FACScan. В анализе учитывали флуоресцентные сигналы, накопленные до уровня 30 000 регистрируемых событий на каждый образец.