3.1. Обоснование рецептурного состава композиции ферментов и ее содержания к массе кс

Литературные данные, а также результаты проведенных нами ранее исследований свидетельствует о возможности и целесообразности создания композиций протеолитических ферментов, предназначенных для обработки мясного сырья с повышенным содержанием белков соединительной ткани [129]. Так, исследованиями Горбаня В.Г. установлено, что для обработки мясного сырья, содержащего 3,5…3,7% белков соединительной ткани, может быть использована композиция ферментов на основе фермента микробного происхождения протомегатерина Г20Х и растительного фермента папаина. Показано, что одновременное использование двух ферментов позволяет усилить их активность относительно коллагена. Основываясь на этих данных, нами были продолжены исследования по разработке композиции ферментов на основе протомегатерина Г20Х и папаина, использование которой позволило бы направленно формировать функционально-технологических свойства КС в процессе его ферментативного протеолиза.

При разработке рецептурного состава композиции ферментов оптимизацию соотношения в ней ферментов протомегатерина Г20Х и папаина, а также количество композиции к массе КС проводили, используя метод полного факторного эксперимента с последующим математическим моделированием в проблемно ориентированном пакете MathCad.

Ферментативный протеолиз КС проводили, руководствуясь требованиями ГОСТ 20264.2–88 [70]: при температуре 30° С, рН среды 7,0 (для нейтральных протеаз), продолжительности – 10×60 с.

В качестве параметра оптимизации использовали показатель содержания водорастворимых продуктов гидролиза КС (А)– смеси жилок и сухожилий (получение БП предусматривает частичный гидролиз коллагена до желатоз).

В рамках двухфакторной модели эксперимента моделирование количества ферментов к массе КС и их соотношения в композиции проводили при соблюдении следующих условий:

– исходная таблица полного факторного эксперимента была рандомизирована (перестроена в случайном порядке) для снижения влияния возможных изменений факторов среды (температуры, продолжительности, рН-среды);

– количество необходимых повторов экспериментов было рассчитано с учетом выполнения условий репрезентативности выборки и статистической повторяемости эксперимента, при этом учитывалось следующее требование – с вероятностью 95% погрешность измерения выходной величины не должна превышать 5%;

– была получена математическая модель зависимости содержания растворимых продуктов гидролиза белков КС от соотношения ферментов в композиции (S_ф) и количества (С_ф) композиции к массе сырья;

– диапазон данных был приведен к стандартному, который используется при постановке и планировании эксперимента (от «-1» до «1»);

– проведена проверка адекватности математической модели с помощью критерия Фишера;

– статистическую значимость коэффициентов уравнений регрессии проверяли с помощью критерия Стьюдента.

В рамках квадратичной модели, состоящей из двух параметров, содержание водорастворимых продуктов гидролиза КС в зависимости от соотношения ферментов в композиции и количества композиции к массе сырья, рассчитывали по уравнению [111]:

(3.1)

где А – содержание водорастворимых продуктов гидролиза, мг/г белка ;

S_ф – соотношение ферментов в композиции;

С_ф – количество композиции, % к массе сырья.

В ходе математического моделирования определена область рациональных значений параметров, приведенная на рис.3.2.

а ) б)

Рис 3.2. Удельное содержание водорастворимых продуктов

гидролиза (А) при различных значениях соотношения ферментов в композиции и ее количества в КС

а) – модель поверхности отклика; б) – зона рациональных значений

Анализируя графические зависимости, следует отметить, что зона оптимальных параметров ограничена следующими значениями: количество композиции к массе сырья – 0,14…0,18%, соотношение ферментов в композиции – 1,16…1,75, что в пересчете на действительные величины составляет: содержание протомегатерина Г20Х – 0,075…0,092 г; содержание папаина – 0,065…0,080 мг.

В дальнейших исследованиях для упрощения расчетов использовали композицию ферментов, в которой соотношение ферментов соответствовало 1,5:1, а концентрация 0,15, что составило для протомегатерина Г20Х – 90 мг, для папаина – 60 мг.

Полученные данные были положены в основу разработки состава композиции ферментов, приведенного в табл. 3.1.

Таблица 3.1

Состав композиции ферментов

Расход сырья на 1000 г композиции ферментов, г
Протомегатерин Г20Х	600
Папаин	400
Масса композиции ферментов	1000

Важным фактором, имеющим решающее значение при проведении ферментативного протеолиза является температура. Известно, что каждый фермент имеет свой температурный оптимум. Выход температуры за пределы температурного оптимума приводит к снижению активности ферментов.

И зучение влияния температуры на активность разработанной композиции представляло особый интерес, поскольку из литературных данных известно, что один из ферментов рецептурной композиции – папаин является достаточно термостойким. При определении протеолитической активности руководствовались требованиями ГОСТ 20264.2–88. Ферментативный протеолиз проводили при рН 7,0, в течение 10×60 с, соотношение ферментов в композиции составило 1,5:1; количество композиции к массе белкового субстрата (КС) – 0,15%. На рис. 3.3. представлены данные об изменениях протеолитической активности композиции ферментов и входящих в ее состав ферментов относительно КС в зависимости от температуры.

Рис. 3.3. Удельное содержание водорастворимых продуктов гидролиза (А)

коллагенсодержащего сырья при различных значениях температуры

ферментативного протеолиза

1 – протомегатерин Г20Х; 2 – папаин; 3 – композиция ферментов (1,5:1)

Анализируя графические зависимости, следует отметить, что активность композиции ферментов, протомегатерина Г20Х и папаина, увеличивается при повышении температуры до 55…60⁰С. Так, активность композиции ферментов при температуре 60⁰С в 5,0 раз выше активности протомегатерина Г20Х и в 1,6 раза выше активности папаина. Полученные данные свидетельствуют о том, что одновременное использование двух ферментов в составе композиции позволяет усилить их активность относительно коллагена.

Согласно полученным данным полная инактивация композиции ферментов наблюдается при температуре 85±2⁰С, что обосновывает возможность ее использования для ферментативного протеолиза КС с последующим прогреванием до температуры выше 85±2⁰С.

Исследовано также влияние рН-среды на активность разработанной композиции ферментов относительно КС. Исследования проводили, руководствуясь требованиями ГОСТ 20264.2–88 [70]. Ферментативный протеолиз проводили при температуре 55…60⁰С, продолжительности ферментации составляла 10×60 с, соотношение ферментов в композиции составило 1,5:1; количество композиции к массе КС – 0,15%, рН-среды обеспечивали использованием буферных растворов с соответствующими значениями рН, в качестве субстрата использовали КС. Полученные данные представлены в табл. 3.2.

Таблица 3.2

Влияние рН-среды на накопление водорастворимых продуктов гидролиза КС (А) при ферментативном протеолизе композицией ферментов

Наименование ферментов	Содержание водорастворимых продуктов гидролиза КС, мкг/мл
	рН-среды
	4,0	5,0	6,0	7,0	8,0	9,0
Композиция ферментов m ПМ Г20Х:m ПАП=1,5:1	110±2	334±6	450±9	500±10	391±7	315±5

Как видно из представленных данных, композиция ферментов проявляет максимальную активность при нейтральных значениях рН-среды. Изменение рН-среды как в кислую, так и в щелочную зоны снижает активность композиции ферментов. Так, при рН 4,0 содержание водорастворимых продуктов гидролиза КС снижается на 88%, а при рН 9,0 – на 37% по сравнению с их содержанием при проведении ферментативного протеолиза при рН 7,0. Полученные данные согласуются с данными литературы о значениях рН-оптимума действия как папина, так и протомегатерина Г20Х, которые находятся в диапазоне нейтральных значений рН-среды [118].