36. Описание процессов связывания молекул кс с активными сайтами биологических мембран в отсутствии диффузионных ограничений.

Ряд ксенобиотиков вызывает биологическую реакцию, взаимодей­ствуя с определенными местами связывания на мембране. Анализ раз­вития мембранотропных эффектов должен опираться на совокупность модельных представлений, отражающих течение двух основных эта­пов: связывание молекул эффектора с некими центрами сродства (рецепторами), инициирующими процесс, и последующее развитие реак­ции (биологического ответа).

При рассмотрении взаимодействия химического агента с биологи­ческими мембранами объектами анализа оказываются процессы дос­тупа эффектора к мембраноактивным центрам, сам акт их взаимодей­ствия и последующее развитие реакции (биологический ответ).

Обычно для анализа кинетических зависимостей в токсикологии и фармакологии используются соотношения, соответствующие случаю отсутствия диффузионных ограничений, т. е. процессы диффузии по­лагаются быстрыми в сравнении с развитием реакции.

В простейшем случае, предполагая, что образование комплекса ли­ганд (ксенобиотик)/мембраноактивный центр происходит при отсутст­вии диффузионных ограничений со стехиометрией 1:1 и независимо­сти мест связывания друг от друга (образование комплекса с одним из мембраноактивных центров не влияет на взаимодействие остальных активных центров с молекулами лиганда), реакция связывания лиганда А с местом связывания (рецептором) R запишется в виде:

k

R + А <–>RA

K1

где к, к - константы скоростей прямой и обратной реакции соответственно.

Полагая общую концентрацию мест связывания - рецепторов (занятых и незанятых) в данной системе, равной Q, при концентрации эффектора С, имеем равенство для скорости изменения концентрации Z-комплексов лиганд-рецептор во времени в условиях избытка лиганда (С » Q):

dZ

––– = k (Q – Z)C – k'Z.

dt

В равновесии dZ/dt = 0 и

QC

Zравн = ––––– .

K + C

Когда процессы диффузии оказываются быстрым и в сравнении с развитием биологической реакции, образование комплексов опишется уравнением

QC

Z(t) = –––––– [1 – e- ^{(k'-kC) t}],

K + C

а процесс разрушения комплексов Z(t) = Z₀e-^{k' t.}где к и к' - прямая и обратная константы скоростей образования комплекса Z; Q - концентрация мембраноактивных центров; С - концен-трация эффектора.

Отношение констант к'/ к = К называется константой равновесия комплекса. Она равна концентрации эффектора, вызывающей половинное насыщение мест связывания. В самом деле, если С = К, то

QК

Z = ––––– = Q/2.

K + К

Скорость образования комплексов во времени будет тем большей, чем выше концентрация эффектора. Скорость же распада от нее не зависит.

Рис. - Концентрационная зависимость связывания эффектора с мембраноактивным центром (J) и диссоциация комплекса при удалении эффектора (2) Стрелкой ( f ) указан момент удаления лиганда

36. Модели биофазы и Хилла, их использование для описания закономерностей взаимодействия веществ с активными центрами биологических мембран.

Когда рецепторы располагаются внутри мембраны, процесс образования комплексов «рецептор–эффектор» развивается иначе. Кривая развития процесса примет S-образную форму.

Для интерпретации используется ряд подходов. Один из них - это описание на базе балансвых уравнений.

Вводится понятие «биофазы» - компартмента, содержащего рецепторы и находящегося в контакте со средой. Биофаза находится в непосредственном контакте с компартментом, являющимся источником эффектора; выход эффектора из биофазы в прочие компартменты – реакция первого порядка; стехиометрия связывания эффектора с активным центром 1:1.

В этом случае

где с - концентрация эффектора в биофазе; В - предельная емкость биофазы; k1, к2*/ - константы скоростей реакций.

Стационарная величина количества образовавшихся комплексов окажется равной

где K₁ = k₁ */k₁ - коэффициент распределения эффектора между биофазой и средой, содержащей эффектор в концентрации С; К2 = k2 */k2 -константа диссоциации комплекса.

При очень малых концентрациях эффектора С и сравнительно небольших значениях K1 и К2 можно предположить Q > Z, В > С и система упрощается:

где α = k₁ С + k₁ ^, + k₃.

Далее процесс отмыва связанного эффектора после перенесения тестового объекта в контрольный раствор

Решения с различными приближениями приводят к описаниям кривых, характеризующихся наличием лаг-фазы .

Можно допустить существование комплексов лиганд-рецептор RA_n с любыми стехиометрическими коэффициентами. Могут существовать многовалентные места (рецепторы), образующие комплексы RA_n путем последовательного присоединения лигандов:

R +A = RA₁,

RA₁ + A = RA₂

. . . . . .

RA_n-1 +А = RA_n.

Если присоединение каждой последующей молекулы лиганда зависит от количества ранее связанных с активным центром, то имеют место кооперативные эффекты (связывание каждым рецептором 2х молекул), причем кооперативность бывает отрицательной и положительной.

Когда присоединение каждой последующей молекулы облегчается вследствие посадки предыдущей, то положительная кооперативность, если наоборот затрудняется – отрицательная.

Пример Положительной кооперативности – связывание кислорода молекулой гемоглобина, которая состоит из 4х субъединиц: двух а- и двух р-цепей. Каждая субъединица может связывать одну молекулу кислорода. Сродство к кислороду отдельного центра связывания (гема) тем выше, чем больше других центров связывания уже занято молекулами кислорода.

Существует несколько приемов установления признаков кооперативности. Препарат рецепторов, насыщенный радиоактивным лигандом, можно перенести в среду, не содержащую его, и измерить скорость диссоциации «меченых» комплексов. При этом часть препарата помещается в раствор, содержащий высокую концентрацию немеченого лиганда, часть - в раствор без лиганда. Если в первом случае скорость распада комплекса выше, это говорит о наличии отрицательной кооперативности: нерадиоактивный лиганд, связываясь со свободными, незанятыми радиоактивными рецепторами, ослабляет меченые комплексы. И если в присутствии нерадиоактивного лиганда скорость диссоциации снижается, говорят о проявлении положительной кооперативности.

Можно рассчитать константы скорости связывания лиганда препаратом рецепторов при высоких и низких концентрациях; если они окажутся различными, это можно рассматривать как признак кооперативности - положительной или отрицательной, в зависимости от того, в каком именно случае эта величина окажется больше.

Еще способ выявления кооперативности - это анализ характера отличий концентрационной зависимости количества связывающегося лиганда от классического уравнения (2). полученные данные в скэтчардовских координатах (рис. 4.6), при вогнутой кривой говорят об отрицательной кооперативности, при выпуклой - о положительной.

Предельному случаю сильно выраженной положительной кооперативности (n>1) соответствует популярное уравнение Хилла. Здесь речь идет о механизме, допускающем лишь одновременное присоединение всех молекул эффектора к рецептору без образования промежуточных комплексов RA1, RA₂... RA_n: