Глава 6. Токсикокинетика
Токсикокинетика (от греч. toxicon - «яд», kinetikos - «движение») - наука, изучающая кинетические закономерности поступления, распределения, метаболизма и выведения токсичных веществ из организма.
Ответ организма на воздействие токсиканта есть функция дозы и времени, поэтому характеризуется токсикодинамическими и токсикокинетическими закономерностями.
Токсикодинамика изучает формирование токсического эффекта, основанное на равновесных процессах (см. главу 5). Но такие данные недостаточны для оценки токсичности вещества.
Токсический эффект, помимо биохимических свойств, определяется также изменением во времени концентраций токсиканта и его метаболитов в органах и тканях организма. Количественно эти изменения характеризуются токсикокинетическими параметрами: константой скорости (k), периодом полувыведения (t1/2), объемом распределения (Vd), клиренсом (CL) токсиканта.
Знание законов токсикокинетики необходимо для разработки системы профилактики токсических воздействий и диагностики интоксикаций. Данные токсикокинетики широко используют при создании новых противоядий и схем их оптимального применения при совершенствовании методов форсированной детоксикации.
6.1. Токсикокинетические модели
Токсикокинетические характеристики ксенобиотика зависят от многих факторов: физических и химических свойств вещества, объема органов и тканей, скорости кровотока, проницаемости капилляров и клеточных мембран, рН биосред и характеристик распределения между кровью и тканями.
Формализовать влияние этих факторов удается благодаря использованию токсикокинетических моделей и математическому аппарату, описывающему эти модели.
В токсикокинетике поведение токсичных веществ в организме рассматривают как движение между камерами (частями системы).
Камера отображает ограниченный в пространстве объем жидкости или ткани в организме с одинаковой концентрацией токсиканта по всему объему (рис. 6.1).
Рис. 6.1. Токсикокинетические модели: одно-, двух- и трехкамерная; ki- константы скорости обмена веществ между камерами
Такому определению камеры могут удовлетворять кровь, лимфа, межтканевая жидкость. Между камерами происходят процессы распределения, обмена и выведения токсичного вещества.
В физиологической токсикокинетике организм рассматривается как набор уравнений массопереноса между отдельными органами и тканями. Между камерными и физиологическими моделями нет противоречий, напротив, они дополняют друг друга.
Практическая цель токсикокинетики определяется в первую очередь количественной оценкой концентрации ксенобиотика в разных средах организма во времени. Эти данные необходимы при диагностике и лечении отравлений, а также при химико-токсикологических исследованиях и судебно-химическом анализе.
Токсикокинетические характеристики ксенобиотика зависят от физических и химических свойств вещества, объема органов и тканей, скорости кровотока, проницаемости капилляров и клеточных мембран, кислотности среды и характеристик распределения вещества между кровью и тканями.
Расчет кинетических параметров обмена веществ между камерами основан на законе пропорциональности скорости обмена и концентрации вещества в камерах.
Например, скорость перехода ксенобиотика (Х) из камеры 1 в камеру 2 равна:
где Сх1 - концентрация Х в камере 1; k12 - константа скорости перехода вещества Х из камеры 1 в камеру 2.
Скорость (V12) перехода ксенобиотика (Х) - величина, измеряемая убылью концентрации (Х) в камере 1 в единицу времени:
где t - время.
В соответствии с законом пропорциональности скорости обмена введены показатели: ка - константа скорости абсорбции ксенобиотика из внесосудистого пространства в центральную камеру 1; кэл - константа скорости элиминации ксенобиотика из камеры 1; к1-2, к2-1, к2-3 - константы скорости распределения ксенобиотика между камерами 1, 2 и 3 соответственно.
Проект "Метаболом человека"
Черновой вариант метаболома - метаболического паспорта человека, который представляет все промежуточные соединения обмена веществ в организме, предложили канадские ученые. Об этом сообщает журнал Nucleic Acids Research.
Метаболом человека по своему фундаментальному значению подобен геному человека - совокупности всех его генов, или протеому - совокупности всех его белков. Это как бы химический аналог генома. И если геном представляет программу жизни, то метаболом - ее ингредиенты. Проект "Метаболом человека" (Human Metabolome Project) стартовал в Канаде в 2004 году. Сейчас ученые из Университета Альберты (University of Alberta) в Эдмонтоне каталогизировали и охарактеризовали 2500 метаболитов, 1200 лекарственных препаратов и 3500 пищевых компонентов, обнаруженных в человеческом организме, и опубликовали эту работу в авторитетном журнале Nucleic Acids Research. Авторы убеждены в том, что эти результаты знаменуют собой начало новой эры диагностики и обнаружения болезней. По их мнению, метаболомный проект окажет на медицину и терапию более существенное влияние, чем проект "Геном человека", поскольку метаболомы в качестве индикаторов здоровья и протекающих в организме физиологических процессов несравненно чувствительнее. "Метаболомы - это осведомители генома", - говорит руководитель проекта профессор вычислительной биологии Университета Альберты Дэвид Вишарт (David S.Wishart). По его подсчетам, единичная замена в нашей ДНК может привести к 100-тысячекратному изменению в уровне метаболизма. А представитель "геномщиков" из того же университета доктор Дэвид Бейли (David Bailey) указывает также на значение метаболома для "предсказания, предупреждения и мониторинга многих генетических, инфекционных и связанных с загрязнением окружающей среды заболеваний".
Метаболом находится в исключительной зависимости от того, что человек ест, где он живет, от времени суток, времени года, общего состояния его здоровья и даже от душевного состояния, отмечается в документе, распространенном Университетом Альберты. Располагая в начале проекта химическими и биологическими данными о наиболее известных метаболитах человеческого организма и об их связи с тем или иным заболеванием, канадские ученые за два с половиной года собрали воедино сведения об оставшихся 95% метаболитов, и так получился черновой вариант человеческого метаболома. "На сегодняшний день большая часть медицинских тестов основана на измерении метаболитов в крови и моче", - считает доктор Вишарт. По его оценке, в рутинных клинических анализах задействовано меньше 1% известных метаболитов, в результате очень многое теряется из виду.
«Метаболическое профилирование» и «биохимическое профилирование» — также широко используемые термины для описания метаболических исследований. Метаболическое профилирование является способом определения качества и (или) количества небольших молекул в биологическом объекте. Анализ может включать один или несколько технологических приемов: таких, как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), газовая хроматография (ГХ), капиллярный электрофорез(КЭФ), МС и ЯМР (81, 82). Исторически профилирование эндогенных метаболитов сводилось к определению специфических соединений или типов соединений. Например, после приема красного вина органические кислоты, находящиеся в моче, или флавоноиды в крови могут быть обнаружены несколькими методами — ГХ-МС, ВЭЖХ-МС или ЯМР. Таким образом, получался «снимок» уровня метаболитов в определенное время и в определенном состоянии. В настоящее время метаболическое профилирование может быть рассмотрено уже в составе (системе) метаболома. Современные аналитические технологии нацелены на качественное и количественное определение всех эндогенных метаболитов в различных типах клеток, тканей и биологических жидкостей. Пока это трудновыполнимо, но ученые ищут пути подобного определения. Проблема заключается в разработке единых (стандартных) аналитических методик определения и регистрации результатов при исследовании биологических объектов.
В течение многих лет определение особенностей метаболизма с помощью скрининга биологических жидкостей было основным методом обнаружения врожденных аномалий метаболизма. Токсикологам необходимо количественное определение специфических метаболитов или классов метаболитов. В настоящее время для обнаружения метаболических маркеров токсичных веществ или лекарственных средств используются самые современные аналитические методы. Для определения большого количества метаболитов стали использовать МС и ЯМР, их разновидности, комбинированные методы (например ВЭЖХ-МС-ЯМР). Данные, полученные в ходе этих исследований для воссоздания реально происходящих процессов in vivo, опираются на установление полной структуры определяемых веществ.
Результаты анализов позволяют классифицировать проявление различных типов токсичности или аномалий в организме. В литературе, посвященной ЯМР-исследованиям, часто используют графические способы представления данных. Получают спектральные картинки, отнесенные к тому или иному метаболому (условно их можно сравнить с характерными паттернами на биочипах). При этом проявляются явные противоречия, касающиеся информации о биомаркерах — метаболитах токсикантов в моче, полученной ранее традиционными методами. Во всяком случае, новейшие тандемные инструментальные методы, например ВЭЖХ-ЯМР, при разделении и определении метаболитов в биологических жидкостях, имеют большие возможности для понимания токсического действия лекарственных средств и других химических веществ. Во многих токсикологических исследованиях в результате мониторинга процессов, происходящих в организме в ответ на действие лекарств, отмечается, что изменения в метаболизме предшествуют гистологическим изменениям. Очевидно, возможность определения однозначных индивидуальных ответных реакций до получения достоверно фиксированных токсикологических или гистологических реакций принесет несомненную пользу пациентам.
В настоящее время метаболомические исследования применяются и для разработки новых лекарств. Доказательством этому является создание в США, Японии и странах Евросоюза небольших компаний по выполнению различных метаболомических анализов для более крупных фармацевтических организаций. Одна из задач этих компаний заключается в быстром получении ранних метаболических маркеров токсичности (или безопасности) лекарств, что может использоваться для оценки качества и безопасности лекарственных средств для животных и людей. Другая задача заключается в открытии новых метаболических маркеров, образующихся в организме человека в ответ на действие лекарств, которые в дальнейшем смогут использоваться для выявления людей, «нестандартно» реагирующих на то или иное вещество. По сути, метаболомика ускоряет процесс создания лекарств и значительно увеличивает шансы на безопасное и эффективное их применение. Метаболомика и метабономика позволяют отличить «нормальный» метаболизм от «измененного».
Каждая биологическая жидкость, анализируемая методом 1Н ЯМР спектрометрии с частотой 800 МГц, имеет свой характерный спектр («отпечаток пальца»), что делает возможным идентифицировать нарушение метаболических профилей не только в крови или моче, но и в извлечениях из ткани клеточных суспензиях. Для этого используют специальные компьютерные программы, анализирующие основные компоненты (АОК) и классифицирующие образцы, согласно их ЯМР спектральным профилям (40, 63). В настоящее время эффективный способ извлечения важной метабономической информации состоит в комбинировании ЯМР-спектрометрии высокого разрешения определяемой биологической жидкости с мультивариантными методами статистики. Основные компоненты (ОК) — новые переменные, созданные от линейных комбинаций стартовых спектральных данных так, что каждый последующий ОК имеет определенное отличие от предыдущего, причем, первый ОК в сравнении с другими имеет разницу в наборе данных в наибольшей степени. Участок первых двух или трех ОК дает лучшее представление о разновидности набора данных в двух или трех измерениях.
Таким образом, создаются карты ОК, способные визуально отразить поведение образцов под влиянием любого ксенобиотика. «Рисунок» ЯМР-спектра биологической жидкости или образца ткани определен его метаболическим профилем (11, 18, 38-40, 64, 65. 76). Это достаточно простой подход для научных исследований. Однако в условиях протекания биохимических процессов in vivo все значительно сложнее, поскольку эффекты, вызванные генетической модификацией, болезнью, пищей, образом жизни, действием введенного препарата, развиваются в режиме реального времени. Для решения подобных многофакторных задач разработаны (и продолжают активно разрабатываться) автоматические методы классификации метабономических данных. На их основе строится математическая модель, предсказывающая правильный выбор класса для каждого образца. Расчетные данные сравнивают с экспериментально полученным ЯМР-метаболическим профилем (13, 15. 16, 20, 21, 23, 42, 43, 52, 75). Методика позволяет количественно описать статистические границы, характеризующие каждый класс образца в терминах их метаболических профилей, и отличить образцы, не принадлежащие ни к одному из классов. Образец может принадлежать как к единственному классу, так и ко многим классам. Построив исчерпывающий ряд моделей, можно предусмотреть классификацию для широкого диапазона биообъектов. В настоящее время, благодаря возможностям такого подхода, установлены биомаркеры токсических повреждений, вызванных рядом ксенобиотиков, генетических повреждений, нежелательных побочных эффектов лекарственных препаратов и пестицидов, фенотипов (метаботипов), сформированных в результате взаимодействия генотипов с внешней средой.
Как уже отмечалось, метаболическое профилирование не связано непосредственно с изучением метаболизма ксенобиотиков. Однако метаболические исследования применялись и для объяснения влияния первичных и вторичных продуктов метаболизма ксенобиотиков на человека. Например, при ЯМР-исследовании мочи и плазмы крови были обнаружены метаболиты, образование которых связано с токсическим действием хлорида ртути, гидразина и ряда антибиотиков.
С помощью ЯМР-анализа были расшифрованы и уточнены многие метаболические процессы — от биосинтеза коферментов в микробах и регуляции метаболизма глюкозы у млекопитающих до реакций переноса метильной группы в структуре метаболита при токсических поражениях печени
Следует отметить, что ни одним из инструментальных методов исследования нельзя полностью показать всю сложность структуры метаболома у прокариот или эукариот. Это зависит от генетической изменчивости, тканевого и клеточного разнообразия, качества питания и огромного числа разнообразных молекул, которые включает в себя метаболом. Аналитики всегда занимались специфическими исследованиями индивидуальных видов (например, гистамин или АТФ) или классов молекул (например, аминокислоты или нуклеотиды), однако цель метабономики состоит в установлении полного набора малых молекул, присутствующих в биологической жидкости. В конце 2002 г. в базе данных КЕГГ (KEGG) насчитывалось более 10.000 соединений, 8.000 из которых имели молекулярную массу 30-1.500 Д. Многие соединения молекулярной массой 1.000-1.500 Д являются пептидами и конъюгатами кофермента А . Среди соединений молекулярной массой менее 1.500 Д большинство находятся в интервале 100-600 Д. К тому же, многие макромолекулярные структуры (например, мембраны) состоят из плотно, но динамично связанных небольших молекул. Поэтому задача аналитика состоит в том, чтобы доступными методами определить качественные изменения метаболитов, различающихся молекулярной массой, поляризацией, зарядом, устойчивостью. Еще одна сложность заключается в неравномерном распределении метаболитов различных веществ (например, глюкозы или стероидных гормонов) в биологических жидкостях и тканях. Поэтому популярность комбинированного метода ВЭЖХ-ЯМР при идентификации компонентов биожидкостей растет. Миниатюризация аппаратуры и возможности измерения пикомолярных количеств образца привлекают к себе большое внимание. Уже существуют экспериментальные системы для ВЭЖХ-ЯМР, соединенные с Фурье-преобразователем, ИК- и масс-спектрометрометрами. В будущем такие системы дадут возможность анализировать смеси добавок полимера или идентифицировать in vivo неизвестные компоненты, не изолируя их в индивидуальном виде.
Определение компонентов в сложных биоматрицах проводят в объединенных аналитических системах ВЭЖХ-ЯМР-МС, что дает возможность быстрой полной и надежной молекулярной идентификации.
На сегодня известны несколько методик, позволяющих использовать системы ВЭЖХ-ЯМР (82). Самая простая из них — обнаружение веществ по ЯМР-спектрам в режиме реального времени, как непрерывного потока хроматографических пиков элюата. Однако практически для обнаружения используются только 1H или 19F ЯМР-спектрометры.
Другой распространенный подход — сохранение частей элюата в капиллярных петлях для более позднего автономного изучения ЯМР-спектра (выбор пика). Кроме того, поток может быть приостановлен в коротких интервалах времени при пропускании его через ячейку ЯМР («разрезание» времени) аналогично использованию диодного множества УФ-датчика. Такая методика позволяет получить спектры от различных частей пика. «Разрезание» времени особенно полезно, если разделение происходит недостаточно и трудно определить времена удерживания. В современных приборах возможен полностью автоматизированный анализ при контроле программного обеспечения. Автоматизированный анализ может быть приостановлен в любое время с возвратом к «ручному» управлению.
С помощью системы ВЭЖХ-ЯМР-МС можно получить ценные масс-спектрометрические данные, которые в дальнейшем будут использованы для оптимального выбора пиков и их ЯМР-анализа. Так, например, можно установить фрагменты гидроксилированного метаболита или глюкуронида токсиканта. ЯМР-спектры биологических образцов (биожидкостей) чрезвычайно сложны и содержат много тысяч резонансных поглощений. Получить максимальную информацию от сложных спектров можно при использовании машинных методов с использованием специальных математических приемов — мультивариантной статистики.
Предел обнаружения и количественный анализ вещества зависят как от природы определяемых молекул, так и от класса технической сложности оборудования (например, разрешения соответствующего ЯМР-спектрометра). Интеграл резонанса в ЯМР прямо пропорционален количеству соединений в ЯМР-образце. Пределы обнаружения современных ЯМР-спектрометров ограничивают определение метаболитами с концентрацией ≥ 0,1 мМ-6. Предел обнаружения в методе ВЭЖХ-МС зависит от концентрации, степени ионизации компонента и технологического приема исследования иона. С помощью современных систем можно обнаружить субпикомолярные количества молекул в 1 мкл. образцов. Фактором, ограничивающим обнаружение ионов, является ионизация молекул в водном растворе. Степень ионизации для определенной молекулы различается в разных образцах. На исследуемый ион влияют солевые и буферные растворы, например ион натрия, быстро образует аддукт с кислородом, вызывая сдвиг в молекулярном ионе от М + Н (М + 1) до М + Na (М + 23). Ионизация молекул может быть подавлена другими ионами при одновременном присутствии. Все это должно быть проконтролировано и учтено при анализе.
Сложная структурная организация
клеток и тканей представляет большие трудности при исследованиях метаболитов. Схема проведения метаболических исследований представлена на рис. 11. Многие типы образцов требуют разрушения клеток и тканей, центрифугирования, экстракции и концентрирования
Например, для исследования образцов крови новорожденных вначале проводят экстракцию крови с фильтровальной бумаги. Экстракт можно либо сразу исследовать в масс-спектрометре, либо сначала хроматографировать, а затем проводить МС-анализ (13). Некоторые стадии могут быть укорочены в зависимости от типа образца и метода анализа. При исследовании биологических жидкостей приготовление образца может включать добавление дейтерированного буфера и внутренних стандартов для ЯМР. Фильтрованные жидкости также могут прямо исследоваться в масс-спектрометре. В любом случае, полное качественное и количественное определение метаболитов в каком бы то ни было образце будет требовать одновременного применения различных методов. Поэтому использование той или иной аппаратуры для метаболических исследований зависит от цели исследования, в частности, от того, является ли задачей исследования полная характеристика метаболической структуры данного образца или сравнительный метабономический анализ. В первом случае оптимальным является использование наиболее чувствительных спектрометров сильного магнитного поля и особых методик. В ряде случаев для определения метаболитов с низким содержанием в пробе может потребоваться комбинированный метод ВЭЖХ-ЯМР. Сравнительные метабономические исследования различных образцов, в которых концентрации солей, белков, величина рН и другие параметры варьируют в ограниченной степени, могут проводиться с помощью спектрометра низкого поля, однако при этом увеличивается общее время исследования. Например, при 300 МГц общее время исследования для достижения нужного уровня чувствительности увеличивается в 4,6 раза по сравнению с исследованием, проведенным при 500 МГц.
Кроме исследований мочи и плазмы крови, метаболические анализы включают также исследование содержимого клетки. Используются различные протоколы, зависящие, главным образом, от того, направлен анализ на гидрофильные компоненты клетки или липофильные. Надежные результаты получают после твердофазной экстракции аналитов. При этом повышается чувствительность при определении нуклеозидов, нуклеиновых оснований и монофосфатов нуклеозидов, но количественные характеристики триглицеридов занижены (ниже контрольных значений).
Метод ЯМР позволяет добиваться почти идеального спектрального разделения компонентов, поэтому анализ смеси, как правило, не требует дополнительного хроматографирования. Однако если число компонентов очень большое или резонансные пики соответствуют больше метаболитам, чем основным компонентам, то используют комбинированный метод ВЭЖХ-ЯМР или ВЭЖХ-ЯМР-МС (82). Изо всех хроматографических детекторов масс-спектрометры в настоящее время имеют наибольшее значение для полного метаболического анализа. Это происходит благодаря быстрому развитию масс-спектральных технологий в последнее десятилетие. Появление электроспрейной ионизации расширило возможности МС при биологических исследованиях; масс-спектры крупных и высокополярных молекул теперь можно обнаруживать либо прямо из биологических образцов, либо после разделения, например, с помощью ВЭЖХ. К тому же, инструментальные методы становятся менее объемными, а исследования с применением компьютерных программ открывают новые возможности. Эффективность масс-спектрального детектирования при метаболических исследованиях связана не только с высокой чувствительностью метода, но и с возможностью разделения метаболитов с помощью масс-спектрометра в соответствии с молекулярной массой при минимальном разрешении 1 а .е.м. Таким образом, в зависимости от разрешения конкретного масс-анализатора, количество полос (пиков) масс-спектра может варьироваться в очень широких пределах. Наложение пиков в масс-спектрах происходит, если анализируемые соединения имеют одинаковую молекулярную массу и одинаковую молекулярную формулу (например, различные гексозы). Такие соединения должны быть либо разделены хроматографически перед МС-анализом, либо подвергнуты тандемной МС-МС. Сегодня существует много типов масс-спектрометров, применяемых для метаболических исследований.
Методы ионизации API и ESI используются для перевода полярных метаболитов в масс-спектрометре из водных растворов в ионы газовой фазы. Как правило, многие гетероатомы и функциональные группы (например, COOH и NH2), содержащиеся в молекуле, склонны к ионизации с помощью API. Однако API не позволяет произвести полную ионизацию всех типов биомолекул. Ионизацию можно увеличить при добавлении некоторых летучих буферов к растворителю (например, уксусная, муравьиная, трифторуксусная кислоты, ацетат аммония). ESI-МС — самый распространенный метод исследования биомолекул, который можно использовать с различными масс-анализаторами: такими, как квадруполь, ToF (времяпролетный) или резонанс Фурье-преобразователь — FT. Важно, что ToF обеспечивает быстрое обнаружение спектров, высокую точность и разрешение. Однако метод ToF-МС имеет некоторые ограничения предела обнаружения, зависящие от природы соединений.
Квадрупольные инструментальные методы, благодаря их способности мониторить ионы, используя тандемную МС (МС-МС или МС2), на сегодняшний день являются золотым стандартом чувствительности и предела обнаружения (82).
Метод FT-MС имеет высокую разрешающую способность и дает четкие пики. Однако он сложен и применяется редко; для того, чтобы FT-МС стал методом выбора при метаболических исследованиях, понадобится время.
Для определения метаболитов, обладающих окислительно-восстановительными свойствами, в биологических образцах (таких, как нейромедиаторы, флавоноиды в плазме, эндогенные антиоксиданты в плазме и метаболомы митохондрий) используются способы высокочувствительного электрохимического детектирования в ВЭЖХ. В зависимости от структуры и природы конкретного метаболита чувствительность метода находится в пределах 5-10 пикограммов.
Эффективность работы систем ВЭЖХ-ЯМР-МС можно подтвердить примером. В нескольких крупных медицинских центрах США был проведен анализ 62 метаболитов мочи, включающих органические кислоты и аминокислоты, у пациентов, отобранных в группы по определенным показателям. Метод дал количественные данные (с отклонениями 15 %) для большинства метаболитов и достоверно идентифицировал 105 из 108 больных с наследственными метаболическими заболеваниями.