Вопрос 2 Криавя роста, особенности отдельных фаз 77

Вопрос 3 лекции Определение параметров роста 79

Вопрос 4. Периодическое и непрерывное культивирование (хемостат и турбидостат) 82

Продуктивность периодических процессов культивирования. 84

Турбидостатное культивирование 86

Турбидостат – это система основным регулирующим фактором которой служит концентрация микроорганизмов, которая обычно измеряется непосредственно в аппарате физическими методами. 86

Специальные устройства, основанные на спектрометрии, нефелометрии автоматически устанавливают скорость разбавления, соответствующую заданной концентрации микроорганизмов. 86

………………………………………………………………………………………. 86

Лекция 2.4 Особенности работы в микробиологической лаборатории. Техника и методика посевов. Методы основных микробиологических определений. Асептика, антисептика 87

Особенности работы в микробиологической лаборатории 87

СЛАЙД 17

Метаболический коэффициент. Метаболический коэффициент аналогичен ферментной активности и равен:

q = м/Y . (9)

Уравнение (9) используется для определения потребностей в субстрате, в частности, это может быть кислород, глюкоза, углерод и т.д.

………………………………………………………………………………………

СЛАЙД 18

Вопрос 4. Периодическое и непрерывное культивирование (хемостат и турбидостат)

Периодическое глубинное культивирование представляет собой закрытую систему, в которой скорость роста биомассы стремится к нулю из-за исчерпания субстрата и накопления ингибиторов. Такие системы всегда находятся в неустойчивом состоянии.

Рост клеток и образование продуктов биосинтеза при периоди­ческом культивировании представляют собой процессы, которые за­канчиваются после некоторого определенного времени.

В 1949 г. Моно модифицировал процесс периодического культивирования по­средством непрерывного введения в хорошо перемешиваемую куль­туру свежей питательной среды при одновременном удалении из си­стемы эквивалентного количества культуральной жидкости с содер­жащимися в ней микробными клетками и продуктами биосинтеза (отьемно-доливной способ).

……………………………………………………………………………………….

Ярким примером промышленного использования периодических процессов–является широкое применение аппаратов культиваторов, биореакторов, ферментёров это всё синонимы.

………………………………………………………………………………………

СЛАЙД 19

Первый отечественный биореактор (АКМ-Ш) был разработан и внедрён в практику для производства первых отечественных вакцин и антибиотиков в стенах Института гигиены и санитарии Красной Армии в 1943 году. Его конструктор Алексей Филиппович Шестеренко. За разработку медицинской аппаратуры А.Ф. Шестеренко в 1952 году удостоен Гос. премии. .…………………………………………………………………………………

СЛАЙД 20 На этом слайде показан современный лабораторный культиватор (полностью автоматизирован процесс ведётся на основе математической модели…). ……………………………………………………………………………….

СЛАЙД 21

Закономерности размножения микроорганизмов при периодическом культивировании можно сформулировать следующим образом:

• размножение микроорганизмов определяется протеканием двух противоположных процессов - образования и гибели клеток, т.е. син­теза и деструкции;

• скорость образования микроорганизмов (синтеза биомассы) пропорциональна все увеличивающейся в процессе их культивирования концентрации X и уменьшается с уменьшением концентрации ли­митирующего субстрата S;

• скорость отмирания клеток (деструкции биомассы) пропорцио­нальна квадрату их концентрации;

• ……………………………………………………………………………….

СЛАЙД 22

• концентрация питательных веществ, необходимых для размно­жения микроорганизмов, определяется содержанием в питательной среде одного или нескольких лимитирующих компонентов;

• продукты лизиса погибших клеток (S*) в кинетическом отноше­нии (количественно, но не качественно) эквивалентны исходному субстрату;

• процесс размножения в условиях периодического способа куль­тивирования заканчивается установлением равновесия, при котором скорости синтеза и деструкции биомассы равны, а поэтому концент­рации микроорганизмов и субстрата не меняются во времени.

……………………………………………………………………………………

Компоненты питательной среды по характеру их превращения в процессе размножения и влиянию на кинетику роста популяции мож­но разделить на две группы:

• вещества, которые при включении в структуру клеток и после­дующем лизисе погибших клеток не претерпевают изменений, и не исключают возможность их повторного использования в метаболическом обмене при образовании новых микроорганизмов;

• вещества, которые в процессе синтеза биомассы претерпевают такие превращения, что их повторное использование микроорганизмами в качестве субстрата невозможно.

Таким образом, кинетическая эквивалентность исходного субстрата и продуктов лизиса погибших клеток в реальной системе клетка- среда может иметь место, если величина субстрата связана с концентрацией в питательной среде веществ, относящихся к первой группе, что и предполагалось при построении модели обратимого равновесного автокаталитического роста популяции.

Продуктивность периодических процессов культивирования.

При периодическом про­цессе культивирования расчет продуктивности должен вестись на всё рабочее время, в которое необходимо включать не только время соб­ственно культивирования, но и время, необходимое для того, чтобы освободить биореактор от предыдущей загрузки, промыть его, про стерилизовать, заполнить новой партией среды и снова простерилизовать эту среду с биореактором. Необходимый для этого период вре­мени может быть как коротким (например, 6 ч при производстве дрож­жей), так и довольно длинным (например, 20 ч при производстве ан­тибиотиков).

Культуры, которые мы рассматривали до сих пор, назывались периодическими культурами; питательные вещества в них не возобновлялись, и поэтому экспоненциальный рост клеток сохранялся только в течение нескольких генераций.

СЛАЙД 23

Непрерывное культивирование микроорганизмов

Микробные популяции можно длительное время поддерживать в состоянии экспоненциального роста, используя систему непрерывного культивирования.

Упрощенная схема системы непрерывного культивирования представлена на слайде.

При таком способе культивирования биореактор присоединяют к резервуару со стерильной средой. В процессе роста клеток из резервуара в культиватор непрерывно поступает свежая среда.

……………………………………………………………………………………….

Объём жидкости в культиваторе поддерживается постоянным за счёт непрерывного удаления её избытка через сливной сифон. Если свежая среда поступает с одинаковой скоростью, концентрация бактерий в биореакторе после начального периода регулировки остаётся постоянной. Иными словами, бактерии в культиваторе растут как раз с такой скоростью, которая достаточна для восполнения клеток, удаляемых через сифон. Если изменить скорость поступления свежей среды, то после очередного переходного периода создаётся популяция с новой постоянной плотностью; скорость роста изменяется в соответствии с новой скоростью потери клеток через сливное устройство.

СЛАЙД 24

Таким образом, система непрерывного культивирования допускает широкое варьирование скорости добавления свежей среды. Однако независимо от скорости притока среды бактерии не могут расти быстрее, чем они росли бы в периодической культуре.

В связи с тем, что в системе непрерывного культивирования плотность популяции сохраняется постоянной, возникает следующий вопрос:

Каким образом скорость добавления свежей среды в культиватор определяет скорость роста культуры?

Объяснение основано на том, что скорость роста бактерий в аппарате для непрерывного культивирования всегда ограничена концентрацией одного из питательных веществ. Следовательно, система является саморегулируемой: скорость добавления свежей среды определяет скорость роста культуры.

СЛАЙД 25

Теперь подробнее рассмотрим аппарат для непрерывного культивирования, который работает при постоянной скорости добавления свежей среды. После инокуляции культура сначала растёт с максимальной скоростью. С повышением плотности клеток будет повышаться и скорость использования питательных веществ до тех пор, пока исчерпание одного из них не приведёт к ограничению скорости роста. Пока скорость роста превышает скорость вымывания клеток через сливной сифон, их плотность продолжает увеличиваться, а равновесная концентрация лимитирующего субстрата в культиваторе продолжает снижаться.

В результате скорость роста будет снижаться до тех пор, пока прирост клеток за счет размножения не станет в точности равным скорости их вымывания через сливное устройство. Если бы скорость роста культуры на небольшой период стала ниже, чем скорость вымывания клеток, плотность суспензии уменьшилась бы, а концентрация лимитирующего субстрата увеличилась. Поэтому и скорость роста стала бы повышаться до её уравнивания со скоростью вымывания клеток.

Используя тот факт, что в системе непрерывного культивирования плотность клеток сохраняется постоянной и саморегулируется, можно дать описание системы в математической форме:

(Скорость образования клеток за счёт роста) = (Скорость вымывания клеток через сливное устройство).

………………………………………………………………………………………

В непрерывной микробной культуре, как мы отметили, рост может поддерживаться в течение длительного времени и может быть достигнуто и поддерживаться установившееся состояние, при кото­ром концентрация клеток, удельная скорость роста и окружающая клетки среда (т.е. концентрация питательных веществ и продуктов) не изменяются со временем. Такое состояние является прямой про­тивоположностью росту в периодической культуре, когда условия в культуральной среде изменяются непрерывно. Вследствие этого не­прерывная культура предоставляет уникальные возможности для исследования реакций микроорганизмов на изменение окружающей среды и для непрерывного продуцирования клеточной массы или др. продуктов в оптимальных условиях.

По степени распространения из систем непрерывного культивирования наиболее широкое распространение получили такие системы как хемостат, турбидостат.

СЛАЙД 26

Хемостатное культивирование

Основой для изучения и применения систем непрерывного глу­бинного культивирования служит анализ функционирования хемостата.

Хемостат – это система основным регулирующим фактором, которой является постоянный химический состав по одному из лимитирующих рост компонентов, тогда как другие компоненты находятся в избытке.

Схема хемостата: 1 – регулятор подачи; 2- лимитирующий компонент; 3- питательная среда; 4- культуральная жидкость; 5- датчик концентрации.

……………………………………………………………………………………….

Хемостатное культивирование представляет собой процесс, при котором в культуру с постоянной скоростью непрерыв­но подается свежая питательная среда, а объем культуры при этом поддерживается на постоянном уровне путем непрерывного отлива части культуральной жидкости.

СЛАЙД 27

Турбидостатное культивирование

Турбидостат – это система основным регулирующим фактором которой служит концентрация микроорганизмов, которая обычно измеряется непосредственно в аппарате физическими методами.

Специальные устройства, основанные на спектрометрии, нефелометрии автоматически устанавливают скорость разбавления, соответствующую заданной концентрации микроорганизмов.

……………………………………………………………………………………….

При культивировании микроорганизмов в режиме турбидостата концентрация микроорганизмов поддерживается постоянной посред­ством регулирования оптической плотности культуры. При превы­шении установленной точки включается насос, подающий свежую среду слайд 28.

СЛАЙД 28

……………………………………………………………………………………….

Поскольку объем культуральной жидкости поддерживается посто­янным (с помощью устройства для контроля верхнего уровня) и про­изводится тщательное перемешивание содержимого, культура при этом разбавляется, а некоторая часть удаляется из емкости.

Несмот­ря на кажущуюся простоту этой схемы, использование ее при иссле­дованиях ограничивается трудностями адекватного регулирования концентрации клеток внутри емкости для культивирования.

Как турбидостат, так и хемостат предполагают применение биореакторов, снабженных мешалками для постоянного и полного перемешивания всех элементов жидкости.

Возможно, также достичь установившегося состояния микробного роста в биореакторе идеального внесения. В отличие от биореак­тора с мешалкой, в данном случае концентрация клеток и питатель­ных веществ изменяется в зависимости от местоположения каждой рассматриваемой точки.

Представляется возможным в биореакторе вытеснительного типа имитировать рост микроорганизмов при пе­риодическом культивировании при условии, что прохождение жид­костью определенного расстояния в этом биореакторе позволит компенсировать цикл инкубации.

Лекция 2.4 Особенности работы в микробиологической лаборатории. Техника и методика посевов. Методы основных микробиологических определений. Асептика, антисептика

Особенности работы в микробиологической лаборатории

Микробиологи имеют дело с популяциями (культурами) микроорганизмов, состоящими из миллионов особей. Культуру, содержащую микроорганизмы одного вида, называют чистой. Если в культуре содержится более одного вида микроорганизмов, она носит название смешанной. В микробиологической практике используют главным образом чистые культуры микроорганизмов. Ввиду того, что в воздухе и на поверхности предметов (на столах, инструментах, одежде), а также на руках, волосах и т.д. всегда имеется большое количество разнообразных микроорганизмов, следует постоянно заботиться о сохранении чистоты изучаемых культур. Требование чистоты культур в значительной степени определяет специфику устройства микробиологической лаборатории и правила работы микробиолога.

Микробиологическая лаборатория включает ряд помещений, где проводят работу с микроорганизмами или подготовку к ней. Под лабораторные комнаты отводят наиболее светлые, просторные помещения, естественная освещенность которых должно составлять не менее 110 лк. Поверхность столов и пол всех лабораторных помещений покрывают легко моющимся материалом — пластиком или линолеумом, а стены на высоту 170 см от пола окрашивают в светлые тона. Основное рабочее помещение оборудовано столами лабораторного типа, шкафами и полками для хранения аппаратуры, посуды и реактивов. Столы имеют подводку электроэнергии и снабжены газовыми горелками.

Кроме основного рабочего помещения лаборатория имеет стерилизацион-ную, где размещены автоклавы и сушильные шкафы, термостатированную комнату для выращивания микроорганизмов, помещение для хранения культур микроорганизмов, холодильную комнату, моечную и т.д. Пересевы микроорганизмов осуществляют в боксах разных конструкций - от изолированных помещений до настольных камер (ламинаров), чистота атмосферы рабочего пространства в которых обеспечивается циркуляцией стерильного воздушного потока внутри камеры.

Работа в ламинарном боксе. Конструкция ламинарного бокса позволяет стерильно работать с микроорганизмами в нестерильном помещении. Ламинарные боксы бывают двух степеней защиты — класса I и класса II. Ламинары класса I оборудованы притяжной вентиляцией нестерильного воздуха из помещения и выходом этого воздуха в то же помещение после фильтрации (защита от микробных аэрозолей) и в строгом смысле слова не пригодны для стерильной работы. Ламинары с защитой класса II образуют внутри бокса поток стерильного воздуха, забор которого происходит из помещения, и который стерилизуется, проходя через бактериальные фильтры. Таким образом, внутренние поверхности бокса остаются стерильными. Конструкция позволяет также проводить стерильные посевы микроорганизмов в струе стерильного воздуха, прошедшего через бактериальные фильтры и распределенного внутри ламинара в виде ламинарного потока (без завихрений). Работа в ламинаре, однако, предполагает использование асептической техники (работа у пламени горелки).

Перед началом работы ламинар должен быть вымыт с помощью растворов нейтральных детергентов и все доступные внутренние его поверхности должны быть простерилизованы химическими дезинфектантами (70%-й этанол). В течение рутинной работы ламинар необходимо мыть раз в месяц, снимая съемные детали поверхности и прочищая пространство под ними. После промывки панели прибора вновь стерилизуют этанолом.

Бактериальные фильтры ламинара необходимо подвергать процессу химической дезинфекции один раз в течение 1 - 2 мес. в зависимости от интенсивности использования. Химическую дезинфекцию внутренней поверхности ламинара и в особенности его фильтров проводят парами формальдегида. С этой целью 50 мл 37%-го раствора формальдегида (формалин) наливают в фарфоровую чашку, ставят на подставку и нагревают чашку для медленного (30 мин) испарения формальдегида. Воздушный насос ламинара должен быть при этом включен для равномерного распределения паров дезинфектанта по внутреннему объему камеры, воздушная заслонка выхода воздуха закрыта, так же как и передняя крышка прибора. При стерилизации ламинара люди должны покинуть помещение. После полного испарения формалина нагреватель и воздушный насос выключают, ламинар оставляют на сутки для дезинфекции и затем проветривают его от остатков паров формальдегида. Для этого открывают переднюю крышку прибора, включают воздушный насос и открывают заслонку выхода воздуха. Прибор оставляют в рабочем состоянии на 15 - 20 мин, и далее он готов к работе. При продувке прибора от паров формальдегида помещение необходимо хорошо проветрить, а люди на это время должны его покинуть.

Подготовка микробиологической лаборатории к работе

Микробиологическую лабораторию необходимо содержать в чистоте. В ней не должно находиться никаких лишних предметов. Следует регулярно проводить гигиеническую уборку лабораторных помещений. Обеспечить полную стерильность лаборатории очень трудно и это не всегда необходимо, но значительно снизить количество микроорганизмов в воздухе и на различных поверхностях в лабораторных помещениях возможно. Для этого применяют различные способы дезинфекции. Слово «дезинфекция» означает обеззараживание, т.е. уничтожение возбудителей инфекционных болезней на объектах внешней среды. Однако при дезинфекционной обработке погибают не только патогенные, но и сапротрофные бактерии. Иногда процесс дезинфекции оказывает стерилизующее действие.