Цикл Кребса, этц и афк.

Цикл Кребса, на ряду с β-окислением жирных кислот, является основным источником восстановленных эквивалент NADH и FADH_2, вступающих затем в ЭТЦ. В ходе этого процесса АФК не образуется, но ЦТК по действием АФК нарушаться, т.к. один из ключевых ферментов – аконитатгидратаза (АкГ), обеспечивающая катализ превращения цитрата в изоцитрат, легко разрушается под действием АФК, т. к. она содержит [4Fe-4S]2+ кластер, в связи с чем, АкГ можно рассматривать в качестве критической мишени действия свободных радикалов. АкГ принадлежит основная роль в регуляции накопления лимонной кислоты. При этом из Fe_S кластера высвобождается ион Fe2+, являющийся прооксидантом.

Дыхательная цепь или цепь транспорта электронов представляет собой совокупность последовательных окислительно-восстановительных реакций, в ходе которых происходит перенос электронов от исходного донора к терминальному акцептору кислороду. Вся цепь реакций проходит при участии белковых молекул - переносчиков. Белковые молекулы встроены во внутреннюю мембрану митохондрий и образуют дыхательные комплексы. Система окислительного фосфорилирования состоит из пяти ферментативных комплексов:

Комплекс I (NADH дегидрогеназа) окисляет NAD-Н, отбирая у него два электрона и перенося их на растворимый в липидах убихинон, который внутри мембраны диффундирует к комплексу III. Вместе с этим, комплекс I перекачивает 4 протона из матрикса в межмембранное пространство митохондрии.

• Комплекс II (Сукцинатдегидрогеназа) не перекачивает протоны, но

обеспечивает вход в цепь дополнительных электронов за счёт окисления сукцината.

• Комплекс III (Цитохром bc1 комплекс) переносит электроны с

убихинона на два водорастворимых цитохрома с. Убихинон передаёт 2 электрона, а цитохромы за один цикл переносят по одному электрону.

• Комплекс IV (Цитохром с оксидаза) катализирует перенос 4 электронов с 4 молекул цитохрома с на O2 и перекачивает при этом 4 протона в межмембранное пространство. Комплекс состоит из цитохромов а и a3, которые, помимо гема, содержат ионы меди.

• Комплекс V (АТФ - синтаза) - комплекс, состоящий из двух частей:

одна часть F0 - это протонный канал, другая часть F1 - выполняющая каталитическую функцию, отвечает за синтез АТФ.

В ЭТЦ восстанавливается 93 - 95% молекулярного кислорода, однако другие 5 - 7% могут оставаться не полностью восстановленными, формируя реакционно активные соединения, свободные радикалы. Другим путем возникновения активных форм кислорода называют дополнительные реакции в цепи, протекающие как спонтанно, благодаря разности окислительно-восстановительных потенциалов или возникновению побочных продуктов реакций, так и за счет вспомогательных реакций, осуществляющих окисление субстратов помимо цепи переноса электронов. Так, при измерении окислительно-восстановительного потенциала реакции преобразования O2 в O2˙ в нормальных условиях (pH 7,0) ученые показывают, что данное значение является промежуточным между потенциалами начального и конечного звена электрон-транспортной цепи и составляет -0,160 В. Сильное увеличение концентрации АФК может приводить к инактивации железосерных центров комплексов I, II и III дыхательной цепи и цис-аконитазы цикла Кребса, что в свою очередь приводит к снижению продукции АТФ митохондриями.

Дыхательная цепь включает окислительные центры с потенциалами от - 0,320 В (NAD(P)H) до +0,39 В (цитохром а3). Следовательно, термодинамически дыхательные компоненты этих центров (железо-серные кластеры, семихинон, флавопротеины) вполне способны к переносу электронов с образованием супероксид аниона. Кроме того, многие этапы переноса электронов содержат одноэлектронные переносчики, которые также способны осуществлять моновалентное восстановление кислорода (промежуточные формы восстановленного кислорода). Образующийся супероксид - анион затем превращается в перекись водорода H2O2 под действием митохондриальной супероксид- анион-дисмутазы, содержащей ионы Mn. Согласно другим данным помимо системы цитохромов источником активных форм кислорода могут являться побочные реакции, такие как метаболизм ксантина, гипоксантина, L- и D-аминокислот: при этом происходит перенос протонов непосредственно на молекулярный кислород с образованием пероксида водорода.

На образование перекиси водорода расходуется до 3% от общего количества кислорода, поглощаемого митохондриями. Митохондрии, выделенные из различных тканей, образуют перекись водорода при аэробном окислении различных субстратов. Наблюдаемая скорость образования перекиси сильно зависит от ткани- источника митохондрий, применяемых субстратов-доноров, ионного состава и рН среды измерения, а также использованного метода опре¬деления АФК. Метаболическое состояние митохондрий прямо связано с их способностью к генерации перекиси водорода: так при контролируемом окислении сукцината в отсутствие ADP продукция Н2О2 максимальна, тогда как в присутствии разобщителей или при добавлении ADP скорость генерации резко снижена. H2O2 в присутствии переходных металлов также может превращаться в высоко реакционно-способный гидроксил-радикал OH .

Продукция любой АФК митохондриями – многофакторный процесс. Например, суммарная регистрируемая скорость образования перекиси водорода в митохондрияхв различных случаях может определяться:

1) активностью транслоказ малата, глутамата и аспартата и малата, пирувата и цитрата;

2) активностями малатдегидрогеназы и трансаминазы и пируватдегидрогеназного комплекса (ПДГК) и цитратсинтазы;

3) активностями ферментов, образующих перекись водорода;

4) активностями внутримитохондриальных ферментов, разрушающих АФК (так называемая система «антиоксидантной» защиты), к которым относятся глутатионредуктаза, глутатионпероксидаза, каталаза, пероксиредоксины, глутаредоксины и две СОД (матриксная и межмембранная);

5) скоростью транспорта образующейся перекиси водорода во внешнюю среду.

В определенных условиях работы электронтранспортной цепи возможно также одно-электронное восстановление кислорода, взаимосвязанное с его более высоким сродством к убихинону по сравнению с цитохромоксидазой. Это сопровождается образованием супероксиданионрадикала. Были выявлены специфические компоненты дыхательной цепи - источники АФК. Они пречислены в таблице 2 (слайд) перечислены митохондриальные ферменты, для которых экспериментально показана их способность образовывать АФК. Содержание этих ферментов в митохондриях разных тканей сильно различается. Так, например, ферменты 1-4 и 7 высокоактивны в митохондриях всех изученных тканей, тогда как активность фермента 8 особенно велика в митохондриях бурого жира и тканях насекомых. Данные об относительной активности ферментов 5, 6 и 9 в различных тканях ограничены и/или противоречивы.

НАD(Р)Н-ОКСИДАЗА (NOX4)

NOX4 - единственный представитель этого семейства, который образует не супероксид-радикал, а перекись водорода, несмотря на то, что молекула кислорода восстанавливается при участии одноэлектронного переносчика (гема b).

Моноаминооксидаза

Дополнительно существенным источником Н202 является окислительное дезаминирование биогенных аминов, протекающее во внутренней митохондриаль¬ной мембране под действием фермента моноаминок- сидазы, что способствует увеличению стабильной концентрации активных форм кислорода в пределах матрикса митохондрий и цитозоля.

Ацил-СоА дегидрогеназа, электронпереносящий флавопротеин и его дегидрогеназа

Электронпереносящий флавопротеин (ЭПФ - естественный акцептор электронов от девяти различных митохондриальных FAD-содержащих ацил-СоА- дегидрогеназ Для окисления восстановленных ацил-СоА-дегидрогеназ требуется 2 эквивалента флавопротеина, так как FAD, входящий в состав ЭПФ, в каталитическом цикле, по-видимому, принимает только один электрон

Дигидролипоамиддегидрогеназа

Фермент - гомодимер с мол. массой 51 кДа. Активный центр каждого мономера представлен центром связывания пиридиннуклео- тидов, молекулой FAD и в непосредственной близости к ней катали¬тически активным дисульфидом. Механизм реакции, ката¬лизируемый ДЛДГ, состоит в восстановлении дигидролипоамидом дисульфидной связи с последующим восстановлением FAD, который переносит гидрид-ион на окисленный NAD+. Эта реакция полностью обратима в отличие от суммарного окислительного декар- боксилирования, сопровождающегося необратимым окислением карбоксильной группы. Изолированная и очищенная ДЛДГ катали¬зирует как восстановление NAD+ дигидролипоамидом, так и восста¬новление липоамида восстановленным нуклеотидом с соизмеримыми числами оборотов. Фермент можно отнести к основному генераторам АФК в митохондриях, катализирует NADH-зависимую аммоний-стимулируемую генерацию перекиси водорода. Не исключено, что токсичное и до сих пор малопонятное действие аммиака у млекопитающих может быть связано с повышением уровня АФК, образующихся при активации ДЛДГ.