Основные редокс-пары клетки

Тиким образом, состояние живых клеток полностью зависит от редокс-статуса их внутренней среды. Многие внутриклеточные процессы чувствительны даже к небольшим изменениям редокс-окружения, что используется клеткой для инициации многих сигнальных каскадов. В основе редокс-сигналинга лежат изменения электрохимического потенциала определенных редокс-пар. Термин редокс- пара обозначает существование в клетке определенного соединения одновременно в окисленном и восстановленном состояниях, причем переход из одного состояния в другое обратим. Важным клеточным редокс-показателем является соотношение окисленной и восстановленной форм подобного соединения. Некоторые из редокс-пар являются универсальными, поскольку выступают связующими звеньями во многих разных клеточных редокс- процессах. В таблице (см. слайды) представлены главные редокс-пары клетки. Редокс-состояние этих пар отражает общее редокс-состояние клетки.

GSSG/2GSH

Главным тиол-дисульфидным редокс-буфером клетки является глутатион, также образующий активную редокс-пару GSSG/2GSH. Глутатион является ключевой молекулой окислительно-восстановительных реакций, связанных с тиол-дисульфидным обменом. Соединение представляет собой трипептид L-γ-глутамил-L-цитенилглицин (таблица на слайде). В клетке глутатион находится преимущественно в восстановленном состоянии, он служит субстратом для ферментов тиол-дисульфидного обмена, которые поддерживают тиолы клетки в восстано-ленном состоянии.

Концентрация восстановленного глутатиона (GSH) в клетках может составлять от 0.1 до 15 мМ в зависимости от типа клеток или клеточного ком- партмента. Клеточное соотношение GSSG/2GSH в среднем составляет примерно 1/100 и может изменяться при окислительном стрессе и апоптозе. S-Глутатионилирование является часто встречаемой посттрансляционной модификацией в белках. В норме регуляция функций многих клеточных белков осуществляется благодаря обратимому глутатионилированию. Степень глутатионилирования многих белков значительно возрастает при патологических состояниях, сопровождающихся масштабным окислительным стрессом. Независимый пул глутатиона в митохондриях защищает белки и липиды матрикса от окислительного повреждения.

Реакции тиол-дисульфидного обмена in vivo катализируются специализированными белками глутаредоксинами (Grx). Grx относят к суперсемейству тиоредоксинов, они найдены практически во всех таксономических группах. Восстановление клеточных дисульфидов благодаря Grx может протекать по монотиольному или дитиольному механизмам, в зависимости от того, участвует в активном центре белка один или два аминокислотных остатка цистеина. Существует несколько изоформ Grx. В клетках млекопитающих выделяют цитоплазматическую изоформу Grx1 и две митохондриальные — Grx2 и Grx5. Окисленный Grx восстанавливается без участия каких-либо ферментов, благодаря пулу GSH.

В свою очередь, для восстановления самого глутатиона и поддержания общего клеточного соотношения GSSG/2GSH на требуемом уровне необходим фермент глутатионредуктаза (GR). GR является FAD-содержащим ферментом, использующим восстановительные эквиваленты NADPH для восстановления GSSG. Схема работы глутаредоксинзависимой системы:

Рис. 1. Принцип работы глутаредоксинзависимой системы. Глутаредоксин (Grx) восстанавливает дисульфидную связь субстрата, окисляясь при этом. Восстановленный глутатион (GSH) неферментативным путем восстанавливает Grx. NADPH-зависимая глутатионредуктаза (GR) поддерживает восстановленный пул глутатиона.

Кроме поддержания общего редокс-статуса всех клеточных тиолов глутатион служит субстратом глутатионпероксидаз (GPx) и, таким образом, участвует в регуляции работы антиоксидантных систем клетки. Помимо Н₂О₂ GPx могут взаимодействовать и с другими пероксидами, встречающимися в клетках. Кроме реакций, опосредованных GPx, GSH напрямую или через другие ферментативные реакции участвует в нейтрализации свободных радикалов, в том числе АФК.

Глутатионпероксидазы катализируют реакции:

1. Восстановления глутатионом нестойких органических гидропероксидов, включая гидропероксиды полиненасыщенных жирных кислот, в стабильные соединения – окси-кислоты: 2GSH + ROOH  GSSG + RОH + Н₂О.

2. Расщепление Н₂О₂: 2GSH + Н₂О₂  GSSG + 2 Н₂О.

3. Расщепление пероксинитрита: 2GSH + ONOO^-  GSSG + NO + H₂O

Глутатионтрансфераза обеспечивает катализ восстановления гидроперекисей органических соединений, включая полиненасыщенные жирные кислоты. Эффективность данного фермента в отношении H₂O₂ чрезвычайно низка Глутатионтрансферазы - белки, использующие восстановленный глутатион для конъюгации с гидрофобными соединениями и восстановления органических пероксидов. Глутатионтрансферазы локализованы преимущественно в цитозоле клеток. Основная функция этих ферментов - защита клеток от ксенобиотиков и продуктов ПОЛ посредством их восстановления, присоединения к субстрату мо¬лекулы глутатиона или нуклеофильного замещения гидрофобных групп:

ROOH + 2GSH = ROH + GSSG + Н2О

R + GSH = HRSG

RX + GSH = RSG + HX.

TrxSS/Trx(SH)₂

Тиоредоксины (Trx) формируют еще одну важную систему клетки, участвующую в тиол-дисульфидном обмене. Trx представляют собой семейство небольших по размеру белков, которые в окисленном (TrxSS) и восстановленном (Trx(SH)₂) состояниях образуют редокс-пару, взаимодействующую с другой редокс-парой клетки — GSSG/2GSH. Процессы тиол-дисульфидного обмена с участием Trx осуществляются благодаря наличию двух остатков цистеина в активном центре этих белков. Уровень Trx в различных клетках примерно в 100—1000 раз ниже уровня глутатиона. Выделяют цитозольную изоформу Trx1, митохондриальную Trx2, секреторную Trx80 и SpTrx, которую обнаружили в сперматозоидах. Подобно глутатиону, белки семейства Trx также образуют независимо контролируемые пулы в разных клеточных компартментах.

В зависимости от типа и состояния клеток редокс-потенциал митохондриального Trx2 находится в диапазоне —360...—340 мВ. Для сравнения, редокс-потенциал цитоплазматического и ядерного Trx1 составляет —280.—300 мВ при рН 7.0.

Trx восстанавливают дисульфидные связи белков клетки, переходя в окисленную форму с образованием дисульфида в активном центре. Восстановление TrxSS осуществляют NADPH-зависимые тиоредоксинредуктазы TrxR. Принцип работы тиоредоксинзависимой системы представлен на рис. 2.

В клетках млекопитающих были выявлены ци¬топлазматическая изоформа TrxR1, митохондриальная TrxR2 и уникальный фермент, который был назван тиоредоксинглутатионредуктазой (TGR), поскольку он участвует в восстановлении Trx и GSSG одновременно.

Механизм: восстановительные эквиваленты транспортируются от NADPH через простетическую группу FAD на дисульфид активного центра TrxR, расположенного в А-концевом домене одной субъединицы. Далее перенос электронов осуществляется на селеноцистеинсодержащий активный центр другой субъединицы, а затем на субстрат.

Метионинсульфоксидредуктаза использует тиоредоксин в качестве восстановителя. Можно полагать, что такая система циклического окисления-восстановления остатков метионина является «встроенной» в молекулы белков отдельной антиоксидантной системой клетки, дезактивирующей опасное действие АФК.

Восстанавливая дисульфиды и защищая многие белки от последствий окисления, тиоредоксины играют важную роль во многих клеточных процессах. Trx участвуют в тонкой регуляции некоторых транскрипционных факторов и влияют на экспрессию генов. Trx выступают в роли доноров электронов для пероксиредоксинов, рибонуклеотидредуктаз, метионин-сульфоксидредуктаз. Являясь регуляторами важнейших клеточных функций, Trx имеют огромное значение для выживаемости клеток, в том числе при патологических состояниях.

NAD+/NADH

В клеточном дыхании одним из главных связующих звеньев является молекула никотинамидадениндинуклеотида (NAD). В клетке NAD одновременно пребывает в окисленном (NAD+) и восстановленном (NADH) состояниях, выступая, соответственно, акцептором и донором восстановительных эквивалентов в совершенно разных клеточных реакциях. NAD+ и NADH являются активной редокс-парой, от значения соотношения NAD+/NADH зависят многие важнейшие процессы клетки. Клеточное соотношение NAD+/NADH является ключевым параметром, который отражает общее редокс-состояние клеток. Благодаря NAD-зависимой регуляции многих белков (различные дегидрогеназы, mono (ADP-Rib)-трансферазы, ADP-рибозилциклазы, сиртуины и другие) от показателя соотношения NAD+/NADH зависят многие важные клеточные процессы, в том числе клеточная смерть, экспрессия некоторых генов и клеточный сигналинг. Поддержание величины соотношения NAD+/NADH на определенном уровне препятствует повреждению внутриклеточных структур от окисления. Также есть данные о том, что в течение жизни в тканях некоторых организмов соотношение NAD+/NADH меняется.

Молекула NAD представляет собой динуклеотид, составные нуклеотиды которого соединены друг с другом через остатки фосфорной кислоты (таблица). Азотистыми основаниями нуклеотидов NAD являются аденин и никотинамид. NAD+ принимает пару электронов от окисляемого субстрата в составе протона Н+ и гидрид-иона Н-. При этом Н+ высвобождается в окружающую среду. Оставшийся атом водорода присоединяется к четвертому углероду никотинамидного кольца, а электрон распределяется в его плоскости. Этот процесс обратим, и восстановленная молекула NADH в дальнейшем может передавать электроны на какой-либо субстрат.

Для большинства тканей общая концентрация NAD+ и NADH составляет примерно 10^-5 М. Наиболее важным клеточным параметром является соотношение окисленной и восстановленной форм данного кофактора. В митохондриях соотношение NAD+/NADH меняется в пределах от 7—8 до 1, в то время как в цитоплазме этот параметр имеет более широкий диапазон значений — от 700 до 1.

Внутренняя мембрана митохондрий непроницаема для обеих форм NAD. Однако в клетке происходит постоянный обмен восстановительными эквивалентами между цитоплазмой и митохондриями, для этого существуют специализированные челночные механизмы. В зависимости от субстратной пары и типа клеток реализуется глицеролфосфатный или малатаспартатный механизмы. Есть результаты исследований, свидетельствующие о транспорте NAD через плазмати¬ческую мембрану клеток.

NAD+ и NADH являются ключевыми факторами энергетического метаболизма клеток, что подробно описано во многих классических учебниках по биохимии. NAD+ выступает в роли универсального акцептора восстановительных эквивалентов, которые образуются в процессе окисления различных субстратов с участием специфичных дегидрогеназ. В цитоплазме NADH может быть вновь окислен. Например, лактатдегидрогеназа осуществляет реакцию превращения пирувата в лактат с использованием NADH. Но главным клеточным потребителем NADH является ЭТЦ митохондрий на уровне комплекса I.

Понимание принципов регуляции энергетического обмена клетки постоянно расширяется благодаря открытию новых взаимосвязей между NAD и различными клеточными компонентами. Например, действие NAD+ на энергетический метаболизм клетки может быть опосредовано через регуляцию белков семейства сиртуинов, модулирующих, в свою очередь, гликолиз, синтез гликогена, а также активность ацетил-СоА-синтетазы . NAD+ и NADH участвуют в регуляции работы митохондрий не только на уровне ЦТК и ЭТЦ, но и на уровне регуляции проницаемости митохондриальной мембраны, определяющей активность всей органеллы в целом.

Установлено, что в регуляции теломеразной активности участвуют NAD+-зависимые ферменты танкиразы. Также у некоторых видов млекопитающих была обнаружена корреляция между активностью ферментов PARP в одноядерных кровяных клетках с продолжительностью их жизни, что может быть связано с участием PARP в процессах репарации ДНК, клеточная гибель осуществляется с участием PARP-1.

Соотношение NAD+/NADH вместе с фосфорилированной формой кофактора NADP+/NADPH задействовано в тонкой регуляции уровня такого важного вторичного мессенджера клетки, как Ca2+ (рис. 4 слайд). Главным образом эта регуляция осуществляется соединениями, предшественниками которых является молекула NAD+. К ним относятся ADP- Rib, сADP-Rib, О-ацетил-ADP-Rib, адениндинуклеотидфосфат никотиновой кислоты (NAADP).

Значение такого клеточного параметра, как соотношение NAD+/NADH, трудно переоценить. От этого показателя зависят энергетические процессы клетки и общее редокс-состояние клетки.

NADP+/NADPH

NADP+/NADPH — еще один пример редокс-пары, функции которой ино¬гда перекрываются с функциями NAD+/NADH. NADPH служит источником электронов для многих биохимических реакций. β-никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADP) отличается от NAD наличием остатка фосфорной кислоты в положении 2' рибозы никотинового нуклеотида (см. таблицу). Этот кофермент встречается во всех типах клеток и также представлен в них в окисленной (NADP+) и восстановленной (NADPH) формах.

Внутриклеточная концентрация NADP в физиологических условиях значительно ниже по сравнению с концентрацией NAD. Однако общий пул NADP в клетке более восстановлен по сравнению с пулом NAD. Общее клеточное соотношение NADP+/NADPH составляет примерно 0.005.

Образование NADP+ в клетке происходит при фосфорилировании NAD+, реакцию катализируют NAD+-киназы (NADKs). Эти ферменты играют важнейшую роль в поддержании общего уровня NADP в клетке, их активность тщательнейшим образом контролируется. Восстановленная форма NADPH образуется в клетке в результате окислительно-восстановительных реакций, катализируемых различными дегидрогеназами. Кроме того, митохондриальная трансгидрогеназа, которая расположена на внутренней мембране митохондрий, осуществляет перенос восстановительных эквивалентов между пулом NAD и NADP. Благодаря этому ферменту восстановление NADP+ может происходить за счет NADH, что повышает эффективность антиоксидантной системы защиты митохондрий.

Таким образом, оба типа ферментов — и NADKs, и митохондриальная трансгидрогеназа осуществляют важнейшую роль в поддержании баланса между клеточными пулами NAD и NADP.

Пара NADP+/NADPH участвует в регуляции многих окислительно-восстановительных реакций клетки, в том числе реакций антиоксидантных систем. Ранее было отмечено, что глутатионзависимая и тиоредоксинзависимая системы используют в качестве восстановительных эквивалентов молекулы NADPH для восстановления глутатиона и тиоредоксина, соответственно. Для некоторых типов клеток характерно связывание большого количества NADPH каталазой — ферментом, осуществляющим деградацию Н₂О₂. NADH поставляет электроны в дыхательную цепь митохондрий.

Белки семейства NOX (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases) являются трансмембранными NADPH-оксидазами. Используя NADPH в качестве донора, эти ферментные комплексы осуществляют перенос электронов через биологические мембраны. Кислород служит акцептором электронов, что приводит к образованию O₂^-, причем это один из главных путей его образования в клетках.

Фагоциты для уничтожения чужеродных клеток используют АФК, в связи с чем, при стимуляции их функционирования происходит резкий подъем дыхательной активности, сопровождающийся возрастанием потребления кислорода в 50 раз. При этом имеет место метаболизация глюкозы через пентозофосфатный путь, что приводит к образованию NADPH. Благодаря этому, фермент - мембраносвязанная NADPH-оксидаза плазмы, обеспечивает катализ одноэлектронного восстановления кислорода за счет переноса электронов от NADPH к FAD и затем к цитохрому b. Продуктом данной реакции являетсясупероксидный анионрадикал.

В фагоцитирующих клетках один из представителей семейства NOX является важнейшим компонентом борьбы с патогенами. NOX2, используя NADPH в качестве донора, осуществляет перенос электронов внутрь фагосомы с цитоплазматической стороны клетки. Это приводит к мощной генерации внутри фагосомы супероксида, быстро превращающегося в H₂O₂. В случае нейтрофилов, благодаря миелопероксидазе, с участием H₂O₂ образуется еще более реактивное соеди¬нение — хлорноватистая кислота (гипохлорид). Позднее генерация АФК была обнаружена и в других типах клеток, большинство из которых не имеют никакого отношения к фагоцитозу. Именно благодаря изучению сложных комплексов этих белков стало понятно, что роль АФК в разнообразных клетках очень велика и не ограничивается одним лишь по¬вреждением клетки, как считалось ранее.

Поскольку пул NADP, как и пул NAD, вовлечен в различные окислительно-восстановительные реакции клетки, многие процессы метаболизма завиcят от соотношения окисленной и восстановленной форм данного кофактора, NADP+/NADPH. Пул NADPH служит главным ресурсом электронов в клетке, поэтому этот кофактор используется в реакциях биосинтеза важнейших молекул, например, жирных кислот, стероидов, аминокислот и других.