Иммунодиагностические реакции

Иммунодиагностические реакции (ИР) широко используются в лабораторной диагностике инфекций и болезней, возникающих в результате иммунодефицитов. Их применяют: 1) для выявления антител в сыворотке крови, т.е. серологической диагностики инфекционного заболевания; 2) для определения вида или серовара микроорганизма, т.е. антигенной идентификации его.

ИР выявляют образование комплекса АГ-АТ. При этом неизвестный компонент определяют по известному компоненту. ИР отличаются высокой чувствительностью (связывание АТ с АГ при ничтожно малых количествах) и специфичностью (определяется особенностью строения активного центра АТ и детерминант АГ). Они характеризуются стадийностью развития. Первая стадия специфическая, невидимая для глаз, характеризуется соединением детерминантной группы АГ с активным центром АТ. В результате образуется комплекс АГ-АТ, утративший растворимость в изотонических растворах. Вторая стадия – неспецифическая, видимая на глаз, причем характер проявления зависит от состояния АГ, АТ и условия среды, в котором происходит взаимодействие АГ и АТ.

При взаимодействии АТ с корпускулярными антигенами (бактерии, животные клетки, др. клетки) наступают видимые невооруженным глазом изменения (например, хлопья агглютината, лизис клеток). Если с АТ соединяются растворимые мелкодисперсные АГ, образование комплексов выявляют в результате предварительной адсорбции АГ (АТ) на корпускулярных веществах (эритроцитах, частичках угля и др.)

Скорость реакции зависит от:

- оптимального соотношения АГ и АТ.

- степени специфичности АГ и АТ.

- рН среды (7, 2 – 7,4).

- концентрации электролитов (0,85% натрия хлорида).

В зависимости от состояния АГ, АТ и особенностей среды, в которой взаимодействуют АГ и АТ, различают реакции агглютинации, преципитации, лизиса, комплемента, нейтрализации и др.

ИР подразделяются на простые (двухкомпонентные, участвуют только АГ, АТ) и сложные (трехкомпонентные и многокомпонентные, участвуют АГ, АТ и реагирующая система - сенсибилизированные эритроциты, культура клеток, кожа восприимчивого животного и др.).

В настоящее время широкое применение получили ИР, в которых участвуют меченные АГ и АТ (р. иммунофлюоресценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы).

Реакция агглютинации (ра) или прямая ра

Агглютинация – это склеивание и выпадение в осадок микроорганизмов или других клеток (корпускулярных антигенов) под действием специфических антител в присутствии электролитов.

РА применяется для серологической диагностики инфекционных заболеваний (реакция Видаля - при брюшном тифе и паратифах, р. Вейгеля - при эпидемическом сыпном тифе, р. Райта - при бруцеллезе и др.) и для серологической идентификации микробов.

В РА участвуют 3 ингредиента:

1) корпускулярный АГ (агглютиноген);

2) АТ (аглютинин);

3) Изотопический раствор хлорида натрия (электролит).

Антигены – взвесь живых и убитых микроорганизмов.

Идентификацию вида (серотипа) микроба, выделенного от больного или внешней среды определяют по известному антителу(диагностической иммунной сыворотки). Положительный результат реакции укажет на то, что неизвестный микроб идентичен тому, который был взят в качестве антигена для приготовления иммунной диагностической сыворотки.

Для приготовления взвеси испытуемого микроорганизма, суточную агаровую культуру бактерий смывают 1-2 мл. физиологическим раствором, доводя концентрацию до 2-х млрд. микробных клеток в 1мл.

При определении неизвестных антител в сыворотке крови больного или реконвалесцента принято пользоваться заранее заготовленными диагностикумами - микробами, убитыми формалином, спиртом, прогреванием, которые готовятся в производственных условиях.

При лабораторной диагностике некоторых инфекционных заболеваний, например, брюшного тифа и паратифов, имеет значение раздельное определение О- и Н- антител в исследуемых сыворотках, т.к. время их появления у больных и сохранение у реконвалесцентов различно. Для этих исследований необходимо располагать соответственно О- и Н- диагностикумами. Для приготовления жгутикового Н-антигена к взвеси агаровой культуры микробов в физиологическом растворе добавляют 0,2% формалина и выдерживают при 37 ºС в течение 24 часов. О- диагностикум получают прогреванием пробирки со смывом агаровой культуры соответствующего микробов кипящей водяной бане в течение 1,5-2 часов.

Антитела (сыворотки):

а) Испытуемая сыворотка от больного или реконвалесцента получается из крови, взятой стерильно из локтевой вены в количестве 1-2 мл в стерильную пробирку; оставляют на 1 час при комнатной температуре или при 37 ºС на 30 минут. Образовавшийся сгусток отделяют от стенок пробирки бакпетлей, затем пробирку оставляют в холодильнике на ночь. Кровь центрифугируют и отсасывают сыворотку.

Готовят последовательно, чаще двухкратные, разведения сыворотки. Обычно разводят в соотношении от 1:50 до 1:800.

Количество неизвестных агглютинирующих антител в сыворотке оценивается по титру - наибольшему разведению сыворотки, которое еще дает реакцию агглютинации (выпадение осадка - агглютинат).

б) Агглютинирующая диагностическая иммунная сыворотка готовится в производственных условиях путем иммунизации кроликов(реже лошадей) соответствующими антигенами (взвесью живых с ослабленной вирулентностью или убитых микроорганизмов, эритроцитов и т.д.).

Полученную иммунную сыворотку, определив его титр, разливают по ампулам с добавлением консерванта. Иногда употребляют высушенную сыворотку.

Изотонический раствор хлорида натрия- 0,85% химически чистой поваренной соли, рН 7,2-7,4.

РА должна сопровождаться контролем АГ и контролем АТ (сыворотки) для исключения спонтанной самопроизвольной агглютинации, которая может наступить в 2-х случаях:

а) при потери антигеном специфичности (он диссоциирован на S-формы в R).

б) при изменении рН реакции в кислую сторону.

Существует два основных метода постановки РА:

1) ориентировочная РА на предметном стекле, наступающая в течении нескольких минут. Применяется только с целью идентификации вида (серотипа) выделенной из организма больного чистой культуры по его специфичности как АГ к серотипу АТ (см. прилож. 3, рис.2) ;

2) развернутая РА в пробирках, которая учитывается через 2 часа выдерживания при 37 ºС и на следующий день стояния при комнатной температуре применяется с целью идентификации микроба и обнаружения АТ в сыворотке крови (см. прилож. 3, рис.1).

РА входит в группу методов, в которых реакция протекает в две фазы:

1) соединение АГ с АТ (специфическая фаза);

2) выпадение образовавшегося комплекса АГ-АТ (агглютината) в растворе солей (электролите) в осадок (неспецифическая фаза).

Антигены поливалентны, а антитела двух – (IgG) или более валентны(IgМ). Соединение их приводит к образованию макроконгломератов, выпадающих в осадок. Причем характер осадка зависит от свойств антигена: жгутиковые бактерии, имеющие Н - АГ, склеиваются жгутиками, при этом образуются крупнохлопчатый осадок, который наступает в течении двух часов при 37 ºС. У безжгутиковых бактерий, имеющих соматический О-АГ, происходит склеивание непосредственно самих клеток и образование мелкозернистого осадка. Такой осадок образуется медленно, в течение 18-24 часов при комнатной температуре.

Достоинства РА: простота и экспрессность.

Недостатки: уступает по специфичности и чувствительности.