Реакции с применением меченых антигенов и антител реакции иммунофлюоресценции.

Реакции иммунофлюоресценции имеют два варианта: ПИФ – прямая иммунофлюоресценция и НИФ – непрямая иммунофлюоресценция.

ПИФ – прямая иммунофлюоресценция, второе ее название – РИФ – реакция иммунофлюоресценции. Данная реакция выполняется на предметном стекле, учитывается с использованием люминесцентного микроскопа и состоит в том, что на стекло наносится изучаемый материал с неизвестным антигеном, фиксируется жидким фиксатором, после чего на препарат наносят специфическую иммунную сыворотку, меченую флюорохромом. Часто в качестве флюорохрома применяют ФИТЦ-препарат (флюоресцеина изотиоционат). Стекло инкубируют во влажной камере 15 минут в термостате при 37 С, после чего промывают проточной водой 2 минуты. В случае совпадения антигена и специфической сыворотки на стекле образуется комплекс антиген-антитело, при микроскопии под ультрафиолетовыми лучами наблюдается свечение изучаемого объекта. При отсутствии свечения реакция считается отрицательной. Схема реакции представлена на рис. 18.

Рис. 18. Схема постановки ПИФ и НИФ.

НИФ – непрямая флюоресценции или РНИФ – реакция непрямой флюоресценции заключается в том, что в данной модификации с помощью известного антигена проводят поик специфических антител в биологическом материала (сыворотке крови пациента). Так, в практике широко распространена РИФ для диагностики сифилиса и подтверждения активности сифилитического процесса.

Этапы постановки следующие:

• На предметном стекле имеется фиксированный антиген (культура бледной трепонемы)

• Наносим сыворотку пациента

• Инкубируем 30 минут во влажной камере в термостате

• Промываем препарат проточной водой в течение 2 минут

• Наносим на препарат антисыворотку, содержащую антитела к иммуноглобулинам человека, меченную ФИТЦ

• Инкубируем 30 минут во влажной камере в термостате

• Промываем 2 минуты проточной водой

• Препарат высушиваем, микроскопируем в ультрафиолетовых лучах люминесцентного микроскопа.

При обнаружении противосифилитических антител в препарате наблюдаем свечение бледных трепонем разной степени интенсивности – от + (одного плюса) до ++++ (четырех плюсов). В случае отрицательного результата препарат остается темным.

Метод радиоиммунного анализа – риа.

В основе метода радиоиммунного анализа (РИА) – маркирование радионуклидом антигена или антител, вступающих в реакцию. Образующиеся иммунные комплексы выделяют из системы и определяют их радиоактивность на счетчиках импульсов. Наибольшее распространение получил радиоиммунный анализ на твердой фазе (твердофазный РИА) с использованием меченных антигена или антител, сорбированных в лунках полистироловых панелей. РИА применяют для выявления микробных антигенов, различных гормонов, ферментов и т.д. Широкое распространение метода ограничивает необходимость создания условий, обеспечивающих безопасность работы с радионуклидами.

Рис.19. Схема постановки радиоиммунного метода.

Этапы постановки реакции

1. Стандартное количество антигена, идентичного меченому радиоактивной меткой (например, I123, I131, либо другими изотопами), наливают в пробирку.

2. Добавляют стандартное количество иммунной сыворотки, специфичной антигену. 70- 80% меченого антигена связывается при этом с антителами, образуя радиоактивный преципитат.

3. Добавляют субстрат, исследуемый на присутствие предполагаемого антигена. Если в субстрате есть антиген, идентичный меченому, то он конкурирует с ним, отнимая антитела. Радиоактивность преципитата при этом снижается.

Чем больше в субстрате антигена, тем меньше радиоактивность преципитата.