2. Электропорация

Ещё одним способом внедрения экзогенной ДНК в клетки является метод электропорации, впервые примененный в 1982 г. Т. Вонгом и Е. Нейманом с сотрудниками. Суть подхода заключается в кратковременном (5 - 20 мс) воздействии электрического поля высокой напряженности (1 - 15 кВ/см) на бислойную липидную мембрану, что приводит к образованию в ней пор. Время существования и размер пор позволяют таким макромолекулам, как ДНК, войти в клетку под действием осмотических сил. Напряженность электрического поля и продолжительность его действия, а также концентрация экзогенной ДНК и количество клеток-реципиентов подбираются экспериментально. Электропорация является наиболее простым, эффективным и хорошо воспроизводимым методом введения молекул ДНК в клетки.

Изменение количества пор в мембране обратимо при условии, что величина или продолжительность импульсов высокого напряжения не превысит критического предела. Размер пор зависит от длины импульсов, силы электрического поля, а также ионного состава среды.

Электропорация была проведена, например, для эмбрионов креветки (Tseng et al., 2000) и моллюсков (Powers et al., 1995).

Недостатком использования электропорации является постепенная деградация и уменьшение экспрессии трансгена со временем (Powers et al., 1995)

3.Биобаллистическая трансформация

Суть метода биобаллистической трансформации заключается в том, что на мельчайшие частички вольфрама, платины или золота, диаметром от 0,1 до 3,5 мкм, напыляется векторная ДНК, содержащая необходимую для трансформации генную конструкцию. Вольфрамовые, платиновые или золотые частички, несущие ДНК, на целлофановой подложке помещаются внутрь биобаллистической пушки. Суспензия животных клеток или эмбрионов, на ранней стадии развития, помещается под биобаллистическую пушку на расстоянии 10-25 см. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В момент сбрасывания давления частички металла с огромной скоростью выбрасываются из пушки и, пробивая мембраны, входят в цитоплазму и ядра клеток. Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по центру, погибают из-за огромного количества и давления частичек металла, в то время как в зоне 0,6-1 см от центра будут находиться трансформированные клетки (Рис.3). Далее клетки или эмбрионы животных переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации.

Бомбардировка микрочастицами была использована, например, для трансформации оплодотворенных яйцеклеток креветки (Gendreau et al., 1995), морского ежа (Akasaka et al., 1995). Зеленин с соавторами (Zelenin et al., 1991) сообщают, что процент выживших клеток после бомбардировки составляет приблизительно 70%, а также ими доказана экспрессия трансгена у некоторых разновидностей рыб.

Главным преимуществом данного метода является высокая эффективность встройки векторной ДНК, а также то, что можно получить трансгенные клетки в самые кратчайшие сроки.

Существенным недостатком этого метода является то, что эмбрионы, подвергшиеся бомбардировке, довольно редко развиваются в полноценных взрослых особей, большая часть из них рано или поздно гибнет (Sin., 1997).