6. Трансформация с помощью сперматозоидов

В 1971 году Bracket и соавт. показали, что после инкубации спермиев кролика с меченной тритием векторной ДНК радиоактивный материал обнаруживается в головках сперматозоидов, причем была доказана экспрессия введенной ДНК. Соответственно, возник вопрос об использовании сперматозоидов в качестве природного вектора, доставляющего ДНК в клетки. В 1989 году это открытие было повторено для других видов.

В литературе имеются противоречивые сведения относительно условий и предполагаемых механизмов взаимодействия экзогенной ДНК со сперматозоидами (Wu et al., 1990; Atkinson et al., 1991). Сообщалось, что на процесс связывания не оказывают заметное влияние ионный состав среды (Macha et al., 1994) и температура ( Кузнецов, Кузнецова, 1995). В других работах отмечен температурный эффект (Wu et al., 1990; Сигаева и др., 1996) и влияние условий инкубации (Sun et al., 1994).

Известно, что только живые сперматозоиды способны ассоциировать ДНК, а максимум связывания наблюдается при высокой подвижности спермиев и концентрации ДНК (Castro et al., 1990; Lauria, Gandolfi, 1993). Некоторое время оставался открытым вопрос, способна ли посторонняя ДНК проникать внутрь сперматозоида в его ядро или она остается на поверхности спермия. В настоящее время при помощи радиоавтографии и иммунохимии показано, что чаще всего чужеродная ДНК локализуется на мембране головки сперматозоида, хотя у некоторых видов ДНК была обнаружена в области ядра (Brakket et al., 1971; Lavitrano et al., 1992)

Обратим внимание на то, что количество ассоциированной со спермиями ДНК варьируется в зависимости от вида животного и других факторов.

В некоторых работах приведены данные, касающиеся "емкости" сперматозоидов для чужеродной ДНК. Так, на примере спермиев морского ежа Paracentrotus lividus, инкубированных в течение 90 мин в присутствии радиоактивной ДНК было показано, что одним сперматозоидом связывается от 3.103 до 104 молекул ДНК (Arezzo, 1989).

Можно разделить трансформацию при помощи сперматозоидов на естественную и искусственную (Кузнецов, Кузнецова, 1995). Под естественной трансформацией понимают непосредственную инкубацию чужеродной ДНК со спермиями, в этом случае происходит спонтанное поглощение ДНК сперматозоидами.

При искусственной трансформации применяют различные способы инкорпорирования чужеродной ДНК в мужские гаметы: липофекция, использование диметилсульфоксида и др (Кузнецов, Кузнецова, 1995)

Главное преимущество данного метода состоит в том, что он не требует дорогого оборудования и специальных знаний в эмбриологии.Также очевидным преимуществом является возможность использования сперматозоидов после криоконсервации и длительного культивирования.

Но существующая частота трансгенеза пока не достаточна для интенсивного использования данного метода при трансформации морских животных. Основные неудачи в экспериментах по получению трансгенных животных с помощью подвижных векторов связаны с низкой копийностью (Nakanishi, Iritani, 1993) и деградацией привнесенной спермиями чужеродной ДНК в ранних эмбрионах (Hochi et al., 1990), а также с отсутствием в подавляющем числе случаев условий, необходимых для интеграции рекомбинантной ДНК в геном зародыша. Также недостатком метода трансформации с помощью сперматозоидов является то, что работать можно только с половыми продуктами (яйцеклетками и сперматозоидами), нельзя использовать соматические ткани.

Связывание ДНК сперматозоидами при различных условиях.

Отмытые от семенной жидкости спермии кролика через 30 мин инкубирования связывали 65 5% радиоактивной ДНК (табл. 2). В присутствии сыворотки крови кролика эта величина составляла 30 3%. Прогрев спермиев в течение 5 мин при 60њС вызывал некроспермию, с клетками связывалось 28 3% ДНК. Добавление семенной жидкости кролика или человека до 50% (об/об) уменьшало количество связанной меченой ДНК соответственно до 17 2 и 16 2%. В присутствии 1 мг/мл хлороквина сперматозоиды сохраняли двигательную активность и связывали 14 2% ДНК. Напротив, 15 мМ азид натрия приводил к обездвиживанию спермиев и связыванию 10 2% горячей ДНК. В присутствии 2,5% глутарового альдегида спермии кролика теряли подвижность и связывали 5 1% ДНК. Когда в суспензию добавляли гепарин (1000 Ед/мл) связывалось 1 1% ДНК. В 3% ДМСО сперматозоиды связывали 78 4% ДНК, а в присутствии 15 мг/ мл БСА доля связанной ДНК составляла 97 2%.