Глава 11. Питательные среды, используемые при определении чувствительности микроорганизмов

К АНТИМИКРОБНЫМ ПРЕПАРАТАМ

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и другим антимикробным лекарственным средствам требует высокой стандартизации всех элементов анализа. Без этого невозможно получить достоверные, воспроизводимые результаты исследования со всеми вытекающими негативными последствиями для терапии больного. Сказанное в полной мере относится к питательным средам.

Существует два основных варианта определения чувствительности: метод серийных разведений и т.н. диск-диффузионный метод. Чаще используют последний, как наиболее доступный и технически, и экономически. Он основан на диффузии в засеянный изучаемым микробом питательный агар антимикробного вещества из картонных (бумажных) дисков. Питательная среда (гель) обеспечивает два параллельно идущих процесса: рост микроба и диффузию антимикробного средства. И тот, и другой должны идти в таком режиме, чтобы могла образоваться зона подавления роста микроба определенного размера в зависимости от чувствительности этого микроба к диффундирующему в гель антимикробному веществу. Если питательная среда не стандартна, если какие-либо компоненты ее изменяют рост микроба (например, ограничивают его или задерживают развитие популяции), если они препятствуют или, что тоже реально, ускоряют диффузию антибиотика в гель, то образующаяся зона окажется не информативной. Заключение о чувствительности микроба к антимикробному агенту будет ложным.

Другой метод серийных разведений основан на способности (или не способности) микроба размножаться в среде, содержащей определенное количество антимикробного средства. Устанавливают минимальную концентрацию, при которой роста популяции не происходит. Значение питательной среды в данном случае очевидно. Если она задерживает размножение микроорганизмов или, наоборот, стимулирует этот процесс, если она не обеспечивает стабильность антимикробного вещества или ингибирует его действие, качественный анализ провести невозможно. Метод серийных разведений может быть реализован и в жидкой и в плотной питательной среде, но это обязательно должна быть среда с определенными свойствами.

Круг питательных сред, которые применяют при изучении чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам, сравнительно невелик. Определяется он в практическом плане в первую очередь тем, существуют ли для установленных условий проведения анализа (включая как важнейший компонент питательную среду) показатели интерпретации результатов анализа. На конкретной по составу среде при строго стандартной схеме исследования чувствительный штамм должен дать зону подавления роста не менее установленного диаметра или минимальная подавляющая концентрация должна быть не более строго определенной величины. То же для устойчивого или промежуточного по чувствительности микроорганизма. Питательная среда не может браться произвольно. Она должна быть определенного состава и обеспечивать надлежащий эффект при контрольном исследовании с референс-культурами.

В России при работе с дисками применяют среду АГВ. Она имеет следующий состав (дано на литр среды):

Питательный агар сухой 41,0 г

Крахмал растворимый 0,5 г

Динатрия гидрофосфат 3,5 г

Рн 7,2 – 7,6

Предусмотренный прописью питательный агар каждый производитель выбирает свой в соответствии с утвержденными ФСП. Среда АГВ тестируется по ряду показателей, в том числе растворимости, прозрачности, рН, аминному азоту, прочности студня и др. Важным элементом является способность среды обеспечивать определенный размер зон подавления роста тест-культур вокруг дисков с антибиотиками (бензилпенициллин, карбенициллин, стрептомицин и некоторые другие). Это важнейший показатель ее качества.

В практике ряда зарубежных государств, а в последние годы в ограниченном объеме и в России, используется среда, предложенная двумя микробиологами США J.Muller и J.Hinton в 1941 г. для выделения нейссерий. В последнем качестве среда испытание временем по большому счету не выдержала. Зато она получила распространение при определении чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Агаризованная (плотная) среда применяется для реализации диск-диффузионного метода, плотная среда или ее жидкий вариант –– метода серийных разведений.

Следует обратить внимание микробиологов на то, что в литературе существует, по меньшей мере, до 7 прописей данной среды, в основе которых лежит исходная композиция. Одна из сред Мюллера-Хинтон предназначена для выделения легионелл, другая –– хромобактерий, третья коринебактерий. Каждая имеет свои особенности. Для обсуждаемой темы –– определение чувствительности, используют питательный агар следующего состава (дано на литр).

Инфуз (вытяжка из мяса говяжьего) 300,0 г

Гидролизат казеина кислотный 17,5 г

Крахмал 1,5 г

Агар-агар 17,0 г

рН 7,4  0,2

Определенное распространение получил также агар Мюллера-Хинтон II, в котором инфуз говяжьего мяса заменен на его экстракт. Он (по разным источникам) используется в количестве 2,0 или 3,0 г на литр. Мясной экстракт признан более стандартным, чем инфуз.

Бульон Мюллера-Хинтон имеет ту же пропись, что приведена выше, за исключением агар-агара.

Добавление 5% бараньей крови к среде Мюллера-Хинтон позволяет использовать ее для определения чувствительности стрептококков, включая пневмококки.

Агар Мюллера-Хинтон с добавлением 2% хлорида натрия рекомендован для определения чувствительности стафилококков к пенициллиназоустойчивым пенициллинам (оксациллин, клоксациллин и др.). Некоторые исследователи считают необходимым увеличить содержание хлорида натрия до 5 – 6%. С их точки зрения такая среда в большей степени позволяет диагносцировать «метициллинрезистентность» стафилококков.

Обогащенный агар Мюллера-Хинтон (НТМ-агар) предложен для определения чувствительности к антибиотикам диск-диффузионным методом Haemophilus influenzae. Его пропись (на литр) включает следующие компоненты.

Инфуз из мяса говяжьего 300,0 г

Гидролизат казеина кислотный 17,5 г

Дрожжевой экстракт 5,0 г

НТМ добавка 10,0 мл

Агар-агар 17,0 г

рН 7,4  0,2

НТМ добавка включает (на 10 мл дистиллированной воды).

Никотинамид аденин динуклеотид 0,03 г

Гематин 0,03 г

НТМ добавка стерилизуется фильтрацией и вносится в расплавленную и охлажденную до 45 – 50^оС питательную среду.

Бульон НТМ имеет ту же пропись, но без включения агар-агара. Его применяют при определении чувствительности гемофильной палочки к антибиотикам методом серийных разведений.

В ряде публикаций в качестве питательной среды при тестировании Н.influenzae диск-диффузионным методом использован шоколадный агар. Однако признано, что НТМ-агар дает более точные и воспроизводимые данные.

Жидкая питательная среда Мюллера-Хинтон является одной из основных для определения МПК методом серийных разведений (варианты макро- и микроразведений). Пропись ее приведена выше (см.пропись агаризованной среды Мюллера-Хинтон с исключением агар-агара).

Согласно рекомендациям NCCLS с целью получения достоверных данных при определении чувствительности микроорганизмов к некоторым антибиотикам (к тетрациклинам для многих культур и аминогликозидам применительно к P.aeruginosa) рекомендовано использовать жидкую среду Мюллера-Хинтон с увтановленным содержанием катионов Ca⁺⁺ (20 – 25 мг/литр) и Mg⁺⁺ (10 – 12.5 мг/литр). Ее в ряде зарубежных руководств помечают как среду САМНВ (cation adjustment of Muller-Hinton broth). Растворы, содержащие необходимое количество катионов, можно приготовить следующим образом. 8,36 г MgCl₂ · 6Н₂О растворяют в 100 мл дистиллированной воды. При этом в 1 мл будет 10 мг Mg⁺⁺. 3,68 г CaCl₂ · 2Н₂О растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Раствор будет содержать в 1 мл 10 мг Ca⁺⁺. Добавляя по 0,1 мл раствора увеличивают на 1 мг содержание в литре жидкой питательной среды Мюллера-Хинтон того или другого двухвалентного металла. Контроль за содержанием кальция и магния осуществляют с помощью прямых тестов физико-химического исследования или косвенно по МПК гентамицина при тестировании референс культуры P.aeruginosa АТСС 27853. При малых МПК необходимо введение в питательную среду катионов, как это обозначено выше, до получения необходимых (табличных) значений.

Определенную характеристику практики использования среды Мюллера-Хинтон в ее плотном и жидком вариантах дает таблица, в которой обобщены рекомендации Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам США. Следует отметить, что за исключением грибов и облигатно анаэробных бактерий, названы все группы микроорганизмов, для которых имеются критерии оценки чувствительности и, соответственно, рекомендованы апробированные питательные среды.

Таблица 10

Питательные среды, рекомендованные NCCLS к использованию

при определении чувствительности бактерий к антибиотикам

(по стандарту NCCLS М100-S9)

Микроорганизм	Диск-диффузионный метод	Метод серийных разведений
		в жидкой питательной среде	в плотной питательной среде
Enterobacteriaceae	МХА**	МХБ РКС***	МХА
Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp*	МХА	МХБ РКС	МХА
Staphylococcus spp	МХА	МХБ РКС	МХА
Enterococcus spp	МХА	МХБ РКС****	МХА
Haemophilus spp	НТМ агар	НТМ бульон	––
Streptococcus pneumoniae	МХА + 5% крови барана	МХБ РКС + 2–5% лизированной крови лошади	––
Streptococcus spp	МХА + 5% крови барана	МХБ РКС + 2 – 5% лизированной крови лошади	МХА с 5% крови барана
Neisseria gonorrhоeae	Гонококковый (GC) агар		Гонококковый (GC) агар с 1% стимулирующей рост добавки
Vibrio cholerae	МХА	МХБ РКС

* Для метода серийных разведений –– все бактерии группы т.н. неферментирующих.

** МХА –– агар Мюллера-Хинтон.

*** МХБ РКС –– бульон Мюллера-Хинтон с регулируемым катионным составом (см.текст).

**** Аминогликозидрезистентность определяется на сердечно-мозговой среде (см.текст).

Определение методом серийных разведений высокой устойчивости энтерококков к аминогликозидам, а также ванкомицинрезистентности рекомендовано проводить с использованием сердечно-мозгового агара или бульона (последний только для выявления аминогликозидрезистентности).

Базовый вариант агаризованной среды включает (на литр).

Вытяжку из сердца крупного рогатого скота 250,0 г

Вытяжку из мозга телят 200,0 г

Пептон 10,0 г

Натрия хлорид 5,0 г

Динатрия гидрофосфат 2,5 г

Глюкоза 2,0 г

Агар-агар 13,5 г

рН 7,4 0,2

Бульон включает те же компоненты за исключением агар-агара.

В ряде прописей вытяжка из сердца и мозга заменена на единый высушенный продукт который добавляется в количестве 8,0 г/литр.

Другие многочисленные варианты плотной и жидкой среды, обогащенные переварами казеина и мяса, антибиотиками, витаминами и др.добавками предназначены для выделения и культивирования микроорганизмов, но не для определения их чувствительности.

Для определения чувствительности к антибиотикам методом дисков гонококков рекомендован ГК агар (гонококковый агар), за рубежом –– GC medium. Следует обратить внимание на большое число питательных сред, помеченных аббревиатурой GC (более 15), причем это среды не обязательно предназначены для работы с гонококками. Кроме того, подразделяют ГК агар на его основу и обязательные добавки, без которых гонококк не будет давать роста или микробный газон окажется неудовлетворительным.

Базовая среда имеет следующий состав (на литр).

Пептон 15,0 г

Кукурузный крахмал 1,0 г

Дикалия гидрофосфат 4,0 г

Калия дигидрофосфат 1,0 г

Натрия хлорид 5,0 г

Агар-агар 10,0 г

рН 7,0  0,2

В прописи АТСС (среда 1351) пептон заменен на панкреатический перевар казеина и пептический гидролизат мяса (по 7,5 г каждого).

В качестве добавок, обеспечивающих рост нейссерий, предложены дефибринированная кровь (5%), растворимый гемоглобин (1%), смесь аутолизата дрожжей с глюкозой, более сложные многокомпонентные добавки с витаминами, нуклеиновыми кислотами, солями, глюкозой. Согласно рекомендациям NCCLS может быть использован следующий состав (на литр).

L-цистин 1,1 г

Гуанин солянокислый 0,003 г

ПАБА 0,013 г

Витамин В₁₂ 0,01 г

Кокарбоксилаза 0,1 г

НАД 0,25 г

Аденин 1,0 г

L-глютамин 10,0 г

Нитрат железа 0,02 г

1% добавки вносится в питательную среду после автоклавирования.

Для определения чувствительности облигатно анаэробных бактерий методом серийных разведений в плотной среде используют обогащенные питательные среды, обычно применяемые для выделения микроорганизмов этой группы. Согласно стандарту NCCLS предложено пользоваться средой для выделения бруцелл, обогащенной кровью, витамином К и гемином. Состав среды на литр.

Панкреатический перевар казеина 10,0 г

Пептон 10,0 г

Натрия хлорид 5,0 г

Дрожжевой экстракт 2,0 г

Глюкоза 1,0 г

Натрий сернистокислый 0,1 г

Витамин К₁ 0,001 г

Гемин 0,005 г

Кровь баранья дефибринированная 50 мл

Агар-агар 15,0 г

рН 7,0  0,2

В ряде исследований для этой же цели был взят мясо-пептонный агар, содержащий от 5 до 10% крови, глюкозу 1 – 2%., витамин К и гемин.

Для серийного титрования анаэробных бактерий рекомендованы также жидкие или полужидкие питательные среды, содержащие вещества, стабилизирующие их редокс-потенциал. В частности, один из таких «анаэробных» бульонов содержит (на литр)

Панкреатический перевар казеина 17,5 г

Глюкоза 10,0 г

Натрия хлорид 2,5 г

Перевар соевой муки 2,5 г

Натрия тиогликолят 2,0 г

Натрия сульфоксилат 1,0 г

L-цистин 0,4 г

Метиленовый голубой 0,002 г

рН 7,20,2

В отечественной и зарубежной литературе приведены исследования, выполненные с использованием тиогликолевой среды, обогащенной бульоном Хоттингера, и среды Китт-Тароцци (без добавления кусочков печени). Последнюю применяли при тестировании клостридий. Прописи этих сред приведены в главе, посвященной питательным средам для анаэробных бактерий.

Для определения чувствительности микроорганизмов диск-диффузионным методом предложен ряд других питательных сред, композиция которых предусматривает возможность роста с образованием достаточного газона самых различных (в том числе требовательных) бактерий. Как правило, это многокомпонентные, сложные по составу питательные среды. Некоторые прописи приведены далее.

DST-агар (агар для определения чувствительности). Выпускается фирмой Oxoid Unipath. Представляет собой вариант «богатой» среды, способной обеспечить рост широкого круга микроорганизмов. Состав среды (на литр).

Пептон 10,0 г

Экстракт из мяса телячьего 10,0 г

Глюкоза 2,0 г

Натрия хлорид 3,0 г

Динатрия фосфат 2,0 г

Натрия ацетат 1,0 г

Аденина сульфат 0,01 г

Гуанина гидрохлорид 0,01 г

Урацил 0,01 г

Ксантин 0,01 г

Тиамин 0,00002 г

Агар-агар 12,0 г

рН 7,4  0,2

К расплавленной и охлажденной до 50^оС среде добавляют 70 мл дефибринированной лошадиной крови (в тех случаях, когда это необходимо для роста микроба).

Разработчики рассматривают данную среду как целесообразную не только для определения чувствительности бактерий, но и для диагностических целей.

В определенной степени ее вариантом является Sensitest Agar того же производителя, содержащий крахмал и панкреатический перевар казеина, а также многие компоненты DST-агара.

Обе среды относятся к числу первых питательных сред, использованных при определении чувствительности микробов к антибиотикам диск-диффузионным методом.

«Изо-сенситетст агар» (Iso-sensitest agar) выпускается по аналогичной прописи несколькими фирмами, но под разными названиями. Приведенная принадлежит Oxoid Unipath (дано на литр).

Гидролизат казеина 11,0 г

Пептон 3,0 г

Натрия хлорид 3,0 г

Динатрия гидрофосфат 2,0 г

Глюкоза 2,0 г

Натрия ацетат 1,0 г

Крахмал растворимый 1,0 г

Магния глицерофосфат 0,2 г

Кальция глюконат 0,1 г

L-Цистеина гидрохлорид 0,02 г

L-Триптофан 0,02 г

Аденин 0,01 г

Гуанин 0,01 г

Урацил 0,01 г

Никатинамид 3 мг

Пантотенат 3 мг

Пиридоксин 3 мг

Марганца хлорид 2 мг

Кобальта сульфат 1 мг

Меди сульфат 1 мг

Железа сульфат 1 мг

Менадион (вит.К) 1 мг

Цианкобаламин 1 мг

Цинка сульфат 1 мг

Биотин 0,3 мг

Тиамин 0,04 мг

Агар-агар 8,0 г

Среда считается пригодной для определения чувствительности к антибиотикам широкого круга бактерий. Подчеркивается, что его состав оптимален для этой цели. Она не требует добавления крови в тех случаях, когда это необходимо для роста микроба на других средах.

Определение чувствительности грибов к антимикробным препаратам остается одной из наименее изученных методических проблем. Часто используют метод серийных разведений в жидкой синтетической питательной среде сложного состава RPMI 1640, которая была создана для культивирования клеток млекопитающих, в том числе для вирусологических исследований при ВИЧ-инфекции. Один из ее вариантов, пропись которой приведена в таблице 11, по рекомендации американских исследователей нашел применение для тестирования чувствительности дрожжеподобных грибов и криптококка к узкому кругу противогрибных препаратов (флюконазол, итраконазол, флюцитозин, кетоконазол, амфотерицин В).

В последние гроды ведется интенсивная работа по внедрению метода дисков для определения чувствительности грибов к противогрибным препаратам. Для этой цели используют среду Сабуро, агар Мюллера-Хинтон, мясо-пептонный агар. Обращено особое внимание на значение рН среды. Для каждого из препаратов этот показатель индивидуален и должен быть учитываем при выборе питательной среды. Возможность применения «метода дисков» при определении чувствительности грибов к противогрибным препаратам сегодня у многих исследователей сомнений не вызывает, однако, вопрос о рациональной для этой цели питательной среде пока остается открытым.

Таблица 11

Состав среды RPMI 1640

Компоненты	г/л	Компоненты	г/л
L-аргинин	0,2	Биотин	0,0002
L-аспарагин (безводный)	0,05	Пантотенат	0,00025
L-аспарагиновая кислота	0,02	Холин хлорид	0,003
L-цистин 2НСI	0,0652	Фолиевая кислота	0,001
L-глютаминовая кислота	0,02	Инозит	0,035
L-глютамин	0,3	Никотинамид	0,001
L-глицин	0,01	ПАБА	0,001
L-гистидин	0,015	Пиридоксин солянокислый	0,001
L-гидроксипролин	0,02	Рибофлавин	0,0002
L-изолейцин	0,05	Тиамин солянокислый	0,001
L-лейцин	0,05	Витамин В12	0,000005
L-лизин HCL	0,04	Нитрат кальция	0,1
L-метионин	0,015	Хлорид калия	0,4
L-фенилаланин	0,015	Сульфат магния	0,04884
L-пролин	0,02	Хлорид натрия	6,0
L-серин	0,03	Фосфат натрия	0,8
L-треонин	0,02	Д-глюкоза	2,0
L-триптофан	0,005	Глютатион (восстановленный)	0,001
L-тирозин	0,02883	Феноловый красный	0,0053
L-валин	0,02