II. Лабораторный практикум

1. Осаждение белков спиртом

2. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами

3. Осаждение белков органическими кислотами

4. Свертывание белков при нагревании

5. Высаливание белков сульфатом аммония

Для проведения реакций осаждения белков пользуются растворами белков, приготовленными ранее (cм. занятие 1).

1. Осаждение белков спиртом

В пробирку наливают 1-1,5 мл раствора белка и добавляют немного кристаллического хлорида натрия. Приливают посте­пенно туда же 5-6 мл этилового спирта. Выпадает хлопьевид­ный осадок белка вследствие дегидратации белковых молекул при добавлении спирта.

2. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами

В три сухие пробирки наливают по 1—2 мл концентрирован­ной азотной, серной и соляной кислот. Затем, наклонив каждую пробирку, осторожно по стенке приливают в нее из пипетки по 0,5мл исследуемого раствора белка так, чтобы он не смеши­вался с кислотой. В месте соприкосновения двух жидкостей появ­ляется белый аморфный осадок белка. При встряхивании осадок, выпавший при действии азотной кислоты, увеличивается, а осадки, выпавшие при действии соляной и серной кислот, растворяются в их избытке.

Концентрированные минеральные кислоты вызывают необ­ратимое осаждение белков. Это связано как с дегидратацией бел­ковых молекул, так и с денатурацией белка.

3. Осаждение белков органическими кислотами

В две пробирки наливают по 2—3 мл раствора белка и до­бавляют в одну из них несколько капель5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, в другую - несколько капель 20%-ного раствора сульфосалициловой кислоты. В обоих случаях наблю­дается выпадение осадка белка.

Сульфосалициловая и трихлоруксусная кислоты являются чувствительными и специфическими реактивами на белок. Трихлоруксусная кислота осаждает только белки и не осаждает про­дукты распада белка и аминокислоты, поэтому ею пользуются часто для полного удаления белков из биологических жидкостей (например, сыворотки крови). В этих условиях продукты распада белков остаются в растворе.

4. Свертывание белков при нагревании

В пять пробирок наливают по 2 мл раствора белка.

а) Нагревают содержимое первой пробирки. Осадок белка появляется еще до того, как жидкость закипит.

б) Добавляют во вторую пробирку одну каплю 1%-ного раст­вора уксусной кислоты и нагревают. Хлопьевидный осадок белка выпадает скорее и полнее вследствие того, что в результате подкисления рН раствора приблизился к изоэлектрической точке белка.

в) Добавляют в третью пробирку около 0,5 мл 10%-ного раст­вора уксусной кислоты и нагревают. Осадок белка не образуется даже при кипячении.

г) Добавляют в четвертую пробирку около 0,5 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты, несколько капель насыщенного рас­твора хлорида натрия и нагревают. Образуется осадок белка.

д) Добавляют в пятую пробирку около 0,5 мл раствора NaOH и нагревают. Осадок белка не образуется даже при кипячении.

5. Высаливание белков сульфатом аммония

Наливают в пробирки 1—1,5 мл раствора белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и слег­ка встряхивают смесь. Появляется муть от выпадающего осадка глобулинов.

Мутную жидкость фильтруют через сухой складчатый фильтр. Часть прозрачного фильтрата нагревают до кипения и наблю­дают свертывание альбуминов, находящихся в растворе. К другой части фильтрата добавляют при перемешивании избыток сульфата аммония в порошке до прекращения его растворения. Появ­ляется муть или хлопья выпадающего в осадок альбумина (срав­нить с исходным фильтратом). Осаждение белков солями являет­ся обратимым процессом, и при добавлении воды белки снова растворяются.