2.5 Определение фунгицидной активности чашечным методом

1. Стерилизуем 12 чашек Петри для высаживания на них смыва микроорганизмов. И еще 10 чашек с нашим покрытием и 2 чашки сравнения. В сушильном шкафе стерилизуем вату, сложенную в конвертике из бумаги. Стерилизация проходит при 180-200 °С один час. Чашки Петри стерилизуются обернутыми в бумагу.

2. Готовим физиологический раствор и стерилизуем в автоклаве 40 мин при давлении 1 атм.

3. Готовим картофельно-глюкозную среду для плесени Mucor Mucedo. Приготовление: 1,0 литр процеженного через марлю отвара из 200 г картофеля, сваренного на дистиллированной воде, с добавлением 20,0 г глюкозы и 20,0 г агара. Плесень растет 4-5 суток при температуре 24 °С.

4. Стерилизуем среду в автоклаве при давлении 1 атм в течении 40 мин.

5. Подготавливаем для работы ламинарный бокс. Протираем его поверхность ваткой смоченной спиртом не менее 70 % и стерилизуем его с помощью УФ-ламп 15 минут. Зажигаем спиртовку. Стерилизуем спиртом автоматические пипетки.

6. Достаем из термостата чашку с плесенью и освобождаем от скотча и готовим суспензию плесени. В пробирку со стерильным физиологическим раствором вносим прокаленной в пламени горелки бактериальной петлей плесень из чашки. Размешиваем получившуюся суспензию.

7. Заражаем чашки Петри с покрытием и 2 контрольных образца следующим образом: в стерильных условиях (в ламинарном боксе) осторожно освобождаем чашки Петри от бумаги. Бумагу сразу выкидываем, чтобы не засорять рабочее место. Набираем автоматической пипеткой 100 мкл суспензии и осторожно приоткрыв крышку чашки Петри вносим суспензию. Даем так, чтобы суспензия покрыла всю нижнюю поверхность чашки. Повторяем эту операцию с оставшимися чашками.

8. Заматываем чашки скотчем. И оставляем на 1 день для взаимодействия микроорганизмов с поверхностью покрытия.

9. Заливаем оставшиеся 12 чашек Петри картофельно-глюкозной средой. Оставляем чашки до посева, замотав их скотчем.

10. Взятие смывов производится с помощью стерильных увлажненных ватных тампонов. Стерильные ватные тампоны на стеклянных, металлических или деревянных палочках, вмонтированных в пробирки с ватными пробками, заготавливают заранее в лаборатории. В день взятия смывов в каждую пробирку с тампоном наливают (в условиях бокса над горелкой) по 5 мл стерильного 0,1 % водного раствора пептона таким образом, чтобы ватный тампон не касался жидкости [6].

11. Непосредственно перед взятием смыва тампон увлажняют средой.

12. Делаем смыв со всей зараженной поверхности увлажненным ватным тампоном и вносим его на чашку Петри со средой. Не забываем подписывать чашки. Повторяем операцию для всех чашек.

13. Чашки со средой со смывом заматываем скотчем и ставим в термостат.

14. Следим за ростом микроорганизмов в течение нескольких дней. Записываем свои наблюдения.

Глава 3 Экспериментальные данные и их анализ

3.1 Выбор состава для нанесения покрытия и его методики напыления

При выборе материала разрабатываемого покрытия принимались во внимание известные сведения о фунгицидно-бактерицидных свойствах тяжелых металлов и их оксидов. В результате были отобраны следующие составы солей: SnCl₄∙5H₂О, CuCl₂+SnCl₄, AgNO₃, CdCl₂+SnCl₄, PbCl₂+SnCl₄, KMnO₄+SnCl₄, MnCl₂+SnCl₄, ZnCl₂+SnCl₄, где хлорид олова является основой для создания тонкопленочных наноразмерных покрытий, в структуре которых будут находиться в качестве включений тяжелые металлы. Так как олово и его оксиды не имеют серьезных ограничений ПДК мы проанализируем его действие в сравнении с составами в составе которых находятся тяжелые металлы.

Технологическую обработку поверхности стекла с целью ее очистки от органических (жировые пленки) и химических (ионные, атомные и т.п.) загрязнений перед операцией распыления спиртовых растворов хлоридов олова и других металлов осуществляется по схеме:

1. Обработка в перекисно-аммиачной смеси (NH₄OH по ГОСТ 3760-79, H₂O₂ по ГОСТ 177-88, H₂O по ГОСТ 6709-72 в соотношении 1:1:3 по объему соответственно) при температуре 40±5 °С в течение 10 минут;

2. Промывка в деионизованной воде при температуре 45±5 °С в течение 10 минут;

3. Обработка в смеси Каро (H₂SO₄ по ГОСТ 4204-77, H₂O₂ по ГОСТ 177- 88 в соотношении 7:3 соответственно) при температуре 145±2,5 °С в течение 1-2 минут;

4. Промывка в проточной деионизованной воде при температуре 65±5 °С в течении 2-3 минут;

5. Сушка облучением инфракрасным светом при температуре 100±3 °С в течение 15-20 минут.

Для нанесения покрытий из оксидных пленок на жесткие подложки могут использоваться 2 известных метода:

1. Магнетронное реактивное распыление;

2. Осаживание из газовой фазы (распыление из спиртовых растворов).

Покрытия, нанесенные обоими методами, имеют похожую структуру в виде коалесцирующих (сросшихся) островков и различаются только меньшим разбросом толщин островков при нанесении первым методом. В связи с тем, что этот параметр не имеет решающего значения, для дальнейших исследований выбран более дешевый второй метод нанесения по пункту 2.3. В результате получаем прозрачные покрытия с радужным поблёскиванием, которое косвенно указывает на наличие покрытия [7].