Микроскопическая техника.

Методики приготовления препаратов

Для цитологических исследований

Цели занятия

• Изучить устройство и принципы работы основных видов световых и электронных микроскопов.

• Выработать представление о сущности и содержании основных этапов приготовления гистологических и электронно-микроскопических препаратов.

• Освоить настройку светового микроскопа и методику микроскопирования препаратов.

Вопросы и задания для самоподготовки

• Основные виды световых и электронных микроскопов, используемых при цитологических исследованиях.

• Основные части световых амплитудного, фазово-контрастного и люминесцентного микроскопов, их назначение, устройство и принципы работы.

• Общие принципы работы трансмиссионного и сканирующего электронных микроскопов.

• Порядок настройки светового микроскопа «МИКМЕД-1».

• Техника микроскопирования гистологических препаратов.

• Основные этапы приготовления гистологических препаратов.

• Основные этапы приготовления ультратонких срезов.

• Характеристика красителей, применяемых в цитологии.

• Характеристика цитохимических красителей.

• Основные этапы приготовления авторадиографических препаратов.

• Основные этапы приготовления иммуноцитохимических препаратов.

• Основные этапы приготовления реплик с биологических структур.

Оборудование и материалы

• Микроскопы «МИКМЕД-1».

• Схемы приготовления цитологических препаратов для светооптических и электронно-микроскопических исследований.

• Наборы красителей.

• Демонстрационные микропрепараты: мазок крови человека, окрашенный по Романовскому-Гимза; срез жировой ткани, окрашенным суданом III-гематоксилином.

Лабораторная работа 1.1 Изучение устройства светового микроскопа

Основным прибором, который используют студенты на занятиях, является световой микроскоп. Он позволяет получить увеличенное и обратное изображения объекта. В микроскопе различают оптическую и механическую части.

Оптическая часть. Эта часть включает в себя объективы, устанавливаемые в гнезда револьверного устройства тубуса, окуляр, расположенный в тубусе, и осветительное устройство. Объектив - сложная система линз. Чаще используют объективы 8×, 20×, 40×, 90×, 100×. По особенностям использования и конструкции объективы подразделяют на сухие (8×, 20×, 40×) и иммерсионные (90×, 100×). При работе с сухими объективами между фронтальной линзой объектива и стеклом препарата находится воздух. При работе с иммерсионными объективами в этот промежуток помещают иммерсионную среду, что позволяет исключить преломления лучей света при их выходе из стекла препарата. В качестве иммерсионных сред используют воду (для объективов, имеющих на корпусе маркировку ВИ и белую полосу) или иммерсионное масло (для объективов с маркировкой МИ и черной полосой). По качеству линз объективы делятся на апохроматы, ахроматы и планохроматы. Ахроматы откорректированы для желто-зеленой части спектра, апохроматы – также и для красно-фиолетовой части спектра. Планохроматы – это ахроматы, исправленные в отношении сферической аберрации и позволяющие получать более плоское поле зрения.

Основной технической характеристикой объектива является разрешающая способность, т.е. наименьшее расстояние, на котором две ближайшие точки объектива воспринимаются раздельно. В световом микроскопе оно определяется в основном длиной световой волны и соответствует третьей ее части.

Разрешающая способность определяется по формуле

E = λ/A,

где λ - длина волны света; А - нумерическая апертура объектива.

Нумерической апертурой называют произведение показателя преломления среды на синус половины отверстного угла объектива:

A=nsinα,

где n - показатель преломления среды; α - половина отверстного угла

По значению апертуры объективы делятся на слабые с апертурой от 0,02 до 0,25, средние от 0,30 до 0,65 и сильные от 0,70 до 1,60. Окуляр увеличивает изображение, данное объективом. Чаще всего применяют окуляры 5×, 7×, 10×.

Окуляр состоит из верхней – глазной линзы и нижней – собирательной. Назначение собирательной линзы – собирать лучи, расходящиеся от объектива, а глазной линзы – увеличивать изображение, сформированное объективом.

С оптической частью связано осветительное устройство, которое включает в себя: осветитель; зеркало (с одной стороны вогнутое, которое используют при источнике света, рассеивающем лучи, а с другой – плоское, которое применяют при работе с осветителями); конденсор, с помощью которого пучок света фокусируется на препарате; ирисовую диафрагму, вмонтированную в конденсор, для изменения степени освещенности препарата. С помощью зеркала пучок света посылается в конденсор и через него на препарат (при изучении препарата в проходящем свете).

Механическая часть. Оптическая часть микроскопа соединена с механическими частями. К ним относят: штатив, колонку с микро- и макровинтами (кремальера), тубус.

Увеличение, получаемое в микроскопе, определяют произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. Если микроскоп оснащен бинокулярной насадкой, его увеличение равно произведению увеличений объектива, окуляра и бинокулярной насадки.

Наиболее распространенные в нашей стране микроскопы типа «МБИ», «Биолам», «МИКМЕД» дают увеличение до 2000 раз.