Слайд 5- 6
Для маркирования стадий развития Т-лимфоцитов чаще используют
экспрессию на их поверхности корецепторов CD4 и CD8, а также рецептор-
ного комплекса CD3–TCR (см. рис. 3.44). Наиболее ранние представители
Т-клеточного ряда имеют фенотип CD4-CD8-, в связи с чем их называют
дважды отрицательными или дважды негативными (DN — от Doublenegative)
клетками. Поскольку они лишены также CD3, эти клетки иног-
да называют трижды негативными клетками. Более зрелая популяция
αβ-тимоцитов экспрессирует оба корецептора и обозначается как дважды
положительные клетки — CD4+CD8+ (дважды позитивные, DP — от Doublepositive).
Они уже экспрессируют на своей поверхности (как правило, слабо)
CD3. Наконец, зрелые тимоциты, как и периферические Т-клетки, экспрес-
сируют один из корецепторов и поэтому их называют моноположительными
клетками (SP — от Single-positive). Как уже упоминалось выше, фенотип
CD4+CD8- характерен для Т-хелперов и регуляторных Т-клеток, а CD4-CD8+ —
для цитотоксических Т-лимфоцитов.
СЛАЙД 9-10
Для удобства рассмотрения этого процесса в стадии дважды
отрицательных DN (тимоцитов) выделяют подстадии по экспрессии двух
мембранных молекул — CD44 (рецептор, распознающий гиалуронат и
ответственный за миграцию клеток-предшественников в тимус) и CD25
(α-цепь рецептора для IL-2). DN1-клетки, мигрирующие в тимус, имеют
фенотип CD44+ CD25-, DN2 — CD44+ CD25+, DN3 — CD44- CD25+.
СЛАЙД 11
Молекулярный механизм рекомбинации всех семи локусов Ig/TCR идентичный. Эти генные перестройки происходят на ранних этапах дифференцировки лимфоцитов в костном мозге (для В-лимфоцитов) и тимусе (для Т-лимфоцитов) и представляют собой соматическую негомологичную рекомбинацию, в результате которой генные сегменты V, D и J сближаются, а промежуточная последовательность удаляется. Для локусов IGH@, TCRD, TCRB перестройка протекает в два этапа: сначала сближаются сегменты D и J, а затем происходит соединение V-DJ. Для остальных генов перестройка V-J происходит в один этап.
Сигнальные последовательности[править | править вики-текст]
Рекомбинация происходит по сигнальным последовательностям ДНК, непосредственно прилегающим к генным сегментам. Эти консервативные сигнальные последовательности называются RSS (англ. recombination signal sequence) и состоят из семи нуклеотидов — 5’-CACAGTG-3’ (гептамер), за которым следует последовательность из 12 или 23 нуклеотидов — спейсер, и ещё одного консервативного блока из девяти нуклеотидов — 5’-ACAAAAACC-3’. Последовательность спейсера может варьировать, но длина консервативна и соответствует одному (12 нуклеотидов) или двум (23 нуклеотида) виткам двойной спирали ДНК. Перестройка происходит только между двумя RSS, одна из которых имеет спейсер 12 пар нуклеотидов, другая — 23 п. н., так называемое «правило рекомбинации 12/23». Эта закономерность строения RSS определяет правильную последовательность рекомбинации: например ген IGH@ имеет RSS длиной 23 п. н. на 3’-конце каждого V-сегмента, RSS длиной 12 п. н. на 3’- и 5’-конце каждого D сегмента и RSS длиной 23 п. н. на 5’-конце каждого J-сегмента. Таким образом, V-J-реаранжировка этого локуса невозможна[6].
V(D)J-рекомбинация представляет собой ряд последовательных реакций сближения, разрывов и воссоединений двойной спирали ДНК и протекает в два этапа. На первом этапе продукты генов RAG1 и RAG2 (англ. recombination activation genes) — распознают RSS и связываются с ними. В формировании комплекса участвуют белки HMG-1 и 2 (high mobility group proteins). Рекомбиназы вносят однонитевой разрыв в ДНК на 5’-конце консервативной последовательности и активируют 3’-OH конец кодирующего сегмента, который фосфатную связь во второй нити ДНК с образованием ковалентно замкнутой шпильки на конце сегмента и «тупых» концов гептамера. Первый этап требует присутствия ионов Mg2+.
На втором этапе реакции тупые концы гептамеров соединяются, образуя так называемое сигнальное соединение. Кодирующие концы перед объединением подвергаются процессингу. Шпилька расщепляется в случайном месте, оставляя иногда палиндромную последовательность, называемую Р-нуклеотидами, на конце генного сегмента. Перед воссоединением генных сегментов концы ДНК могут немного деградировать при участии экзонуклеаз, а также происходит нематричное добавление нуклеотидов терминальной дезоксинуклеотидил-трансферазой (англ. TdT) — так называемых N-нуклеотидов. Наконец, кодирующие концы объединяются. Подобный механизм перестройки называют негомологичной рекомбинацией (англ. NHEJ, non-homologous DNA end-joining). Помимо RAG-рекомбиназ в процессе участвуют другие белки системы репарации/рекомбинации: Artemis осуществляет открытие шпильки, DNA-PK связывается с Artemis для обработки кодирующего конца, белки Ku70 и Ku80связывают и репарируют двухнитевые разрывы ДНК, белок XRCC4 и ДНК-лигаза IV соединяют кодирующие концы[5][7].
Перестройка может протекать по двум механизмам. В случае наиболее типичной делеционной перестройки ДНК между двумя RSS «выпетлевывается», отрезается и образует кольцевой продукт. Инвертированная перестройка возможна, когда сегмент V находится в инвертированном состоянии. В этом случае последовательность, разделяющая две RSS, остается в инвертированном состоянии. Такой тип рекомбинации наиболее характерен для локуса IGK@ (около половины V-J-реаранжировок этого гена). Рекомбинация в норме возможна только между двумя RSS, локализованными на одной хромосоме.[6]
Вариабельность[править | править вики-текст]
Средняя длина генного сегмента V — 300, J — 46-63, D — 17-37 пар нуклеотидов. В процессе перестройки концы генных сегментов могут потерять несколько нуклеотидов, затем они достраиваются случайными нуклеотидами при помощи фермента терминальной дезоксинуклеотидил-трансферазы (англ. TdT). Такие случайные нуклеотиды называются нематричными (N), поскольку они синтезируются без матрицы ДНК и не присутствуют в геноме человека. В каждом акте соединения может быть добавлено от 1 до 30 N-нуклеотидов. Место соединения V, D и J называется соединительным участком, и кодирует третью гипервариабельную петлю белковой цепи вариабельного домена иммуноглобулина, находящегося в антиген-связывающем центре рецептора. Неточность соединения генных сегментов и добавление нематричных нуклеотидов является источником вариабельности, которое увеличивает антиген-распознающий репертуар на несколько порядков. Наибольшая вариабельность возникает при рекомбинации генов IGH@ и TCRB[6].
Реаранжировка происходит в основном при переходе от стадии DN2
(CD4+ CD25+) к стадии DN3 (CD44- CD25+), которые называют также стади-
ями про-Т и пре-Т, соответственно (см. рис. 3.43). На этих стадиях экспрес-
сируются гены RAG1 и RAG2, ген фермента TdT и гены других компонентов
рекомбинационного комплекса. Перестройка V-генов TCR происходит, как
принято считать, в последовательности δ, γ, β. Однако это правило соблю-
дается не очень строго: все 3 гена начинают перестраиваться практически
одновременно. Как и в случае V-генов иммуноглобулинов, сначала пере-
страиваются гены только на одной хромосоме. В генах β- и δ-цепей сбли-
жаются сегменты D и J, а затем происходит полномасштабная перестройка
с вовлечением основного сегмента V-гена и формированим непрерывных
последовательностей VDJ. Реаранжировка генов γ-цепи проходит так же, но
с одним отличием: поскольку в гене γ-цепи отсутствует D-сегмент, в резуль-
тате перестройки формируется последовательность VJ. Как и при реаран-
жировке V-генов иммуноглобулинов, при неудачной перестройке V-гена
на одной хромосоме процесс повторяется на другой хромосоме. Успешная
перестройка служит сигналом к прекращению этого этапа реаранжировки.
Это обусловливает экспрессию клеткой только одного варианта продуктов
перестроенных V-генов. Реаранжировка V-генов TCR делает невозможной
дифференцировку про-Т-клеток в направлении NK- и дендритных клеток.