Жануар шикізатынан ферменттер өндіру. Асқазанның шырышты қабатындағы ферменттің препараттары.

Жануарлардың ағзалары мен ұлпалары осы уақытқа дейін фермент өндірісі үшін маңызды шикізат болып табылады. Бұдан басқа ет өндіру өнеркәсібінің қалдықтары (ұйқы безі, шошқа ішегінің шырышты қабықшалары, ірі қара малдың мүйізі, сүтті бұзау, жыныстық жағынан жетілген тұқымдар) да пайдаланылады. Олардың өңдірілуі бойынша маңызды тәжірибе жинақталған, бір шикізат көзінен бірнеше препарат алудың жүйелі технологиялық сызбанұсқасы жасалды. Алайда жануар шикізатын пайдалану қажетті мөлшердегі ферменттерді алу үшін союға арналған малдың ұлпаматериалдарының көп мөлшерін өндіруге негзделген бірқатар қиындықтары да бар.

Пепсин (Petrium) – протеолиттік ферменті бар препарат. Пепсин алуға арналған шикізат шошқаның асқазанындағы шырышты қабат болып табылады, ол профермент – пепсиноген түрінде түзіледі. Пепсиноген хлорсутекті қышқылмен және аутокатализді түрде, яғни пепсиннің түзілген молекуласы көмегімен белсендіріледі. Бұл кезде пепсиногеннен (м.м. 40 000) алдымен қалдық полипептид, содан кейін пепсин ингибиторы ыдырайды. Белсенді пепсин (м.м. 34 000) түзіледі. Пепсин белсенді ортадағы дикарбонды аминқышқылының қалдықтарынан рН мәндері 1;5 оптимум мәнінен тұратын, карбопротеиназадағы жатады.

Протеолиттік фермент түзілу барысында негізгі тапсырма оны белсенді формада алу болып табылады. Сондықтан, экстракцияны автолиз деп атайды.

Ұсақталған тіндер, хлорсутек қышқылмен рН мәні 1,9-2,3 мәніне дейін қышқылданған сумен суғарады. Шикізат пен экстрагент қатынасы 10:1 болады. Оны шамамен 40⁰С температура кезінде қойып қояды, және 8 сағат бойы араластырады және қайталайды. Лизаттарды төгеді, майдың жоғары қабатынан бөледі де ажыратады, тазалайды. Ферменттік массаны тұздай отырып бөледі, үздіксіз араластыра отырып 20-25% натрий хлориді ерітіндісін қосады. Ерітіндіден бөлінген пепсин бетке қалқып шығады. Оны бөледі, вакуум – кептіргіш шкафта 35-40⁰С температура кезінде кептіреді, фарфорлы шар диірменде ұсақтайды да, оны елегіштен өткізеді. Препаратты протеолитті белсенділігі бойынша стандарттайды (тауық жұмыртқасындағы ақуызды қорытады): 10 г ақуызды 0,1 г препарат қатысында стандартты жағдайда опалесциялаушы ерітінді түзе отырып, 3-4 сағаттан кейін толық еріп кетуі тиіс. Биологиялық белсенділігін тексергеннен кейін препаратты қант ұнтағымен араластырады. Ол сәл сары түсті ұнтақ, өзіне тән әлсіз тәтті дәмі бар. Оны өте жақсы мұқият жапсырылған банкада салқын жерде ( 2-15 ⁰С) сақтайды, жарық түспеуі тиіс. Ас қорыту жүйесінің бұзылысы ( гипо және анацидті гастрит, диспесия) кезінде пайдаланады. Ішкі ацидтермен бірге ерітінді түрінде тағайындайды.

Ацидин-пепсин(Acidin-pepsinum) бір бөлік пепсиннен және 4 бөлік бетаин гидрохлоридтен тұратын, 0,5 және 0,25 г бойынша таблеткада шығарылады. Асқазанға енгізу кезінде бетаин гидролхлорид бос хлорсутек қышқылын түзе отырып жеңіл гидролизденеді.

Абомин (Abominum) – протеолитті ферменттер қосындысынан тұратын препарат, бұзау мен қозының сүт жасында асқазандарының шырышты қабаттарынан алады. Ол арнайы иісі бар аморфты ұнтақ, тұзды дәмі бар (натрий хлориді қосылысынан тұрады). Таблетка формасында 0,2 г-нан шығарылады, бір таблеткада 50 000 ЕД.

Табиғи асқазан сөлі (Succus gastricus naturalis) И. П. Павлов ұсынған әдіс бойынша ит немесе басқа жануарды (аттарды) тамақтандыру барысында асқазан фистуласы арқылы алады. Препарат ащы дәмі бар түссіз, мөлдір сұйықтық, салицил қышқылымен (0.03-0,04%) консервіленген. Ол асқазан сөлінің барлық ферменттерінен, 0,45-0,51 % бос хлорсутек қышқылынан тұрады, рН мәні 0,8-1,2. 100 мл флакон бойынша шығарылады. Жарықтан қорғалған жерде, 2-10⁰С температура кезінде сақтайды. Асқазан безінің жеткіліксіз функциясы барысында қолданылады.

Панкреатин (Pancreatinum) – препарат ұйқы безінің ферменттерінен, яғни бастылары трисин мен амилаза және аз мөлшерде липазадан тұрады. Панкреатинді алуға арналған шикізат шошқа немесе ірі мүйізді малдың асқазан асты безі болып табылады.

Ұйқы безінде протеолиттік фермент профермент түрінде түзіледі: трипсиноген, химотрипсиноген. Бұл ферменттерді белсендіру үшін протеиназ белсенді орталығын бүркейтін полипептидті тізбек фрагментінің гидролизімен жүреді. Панкреатинді алу барысында ұйқы безінің проферменттерін белсендіру сілтілік ортадағы экстрактыде кальций иондарының қатысында жүзеге асады. Сойылған малдың ұйқы безінің тіндерін усақтайды және 5 мл сірке қышқылының 1 л суда еріген ерітіндісінде қышқылданған сумен жуады. Шикізаттың біраз уақыт тұруын 4 сағат бойында 10⁰С температура кезінде араластырғышы бар реакторда жүргізеді. Экстрактты центрифугалау арқылы немесе сүзу көмегімен бөліп алады. Экстраттағы проферментті белсендіру үшін рН мәні 8,1 болатын орта құрады; кальций хлоридин қосады, бұл 0,05М ерітінді даярлау үшін керек, панкреатин қосады. 4⁰С температурасы кезінде 24 сағат бойы тұрады.

Содан сон, рн мәні 6,0 болғанша қышқылдатады, сосын изоэлектрлік нүктеде ілеспе заттарды тұндырады. Тұнбаны бөліп алып, ацетонмен майсыздандырады және вакуум-кептіргіш шкафта 40⁰С температурадан жоғары емес температурада кептіреді. Шарлы диірменде ұсақтайды.

Панкреатинді протеолиттік белсенділік бойынша ақуыздың әлсіз сілті ортасында казеинді қорыту қабілеттілігін стандарттайды. Панкреатин 1г 25-33 ЕД құрауы тиіс. Препаратты ұнтақ және таблетка, қабықпен оралған түріндеде шығарады. Мұқият жапсырылған банкада, құрғақ әрі салқын жерде сақтайды. Ұйқы безінің жеткіліксіз функциясымен асқынған панкреатитте қолданылады.

Ірі қара мүйізді малдың ұйқы безінен сондай-ақ дезоксирибонуклеазалар (ДНҚ), рибонуклеаза (РНҚ), трипсин, химотрипсин, нуклеаза ингибиторлары- пантрипин мен инсулин сияқты ферменттер алынады.

Бұл препараттарды алу технологиясын бүкілодақтық ғылыми-зерттеу орталығының ет өнеркәсібінің органопрепараттар лабораториясы ұсынды.

Өңдіру қағидасы ұсақталған ұйқы безін автолизге айналдырады да судың жартылай мөлшерімен араластырады және 18 сағатқа 12⁰С температурада қалдырады. Содан соң араластырғышы бар реакторда рН = 2,0-2,5 дейін ортофосфор қышқылымен қышқылданған сумен бисмацерация әдісімен экстракция жүргізеді, бұл кезде температура 5⁰С-тан аспауы тиіс. Бірінші мацерация судың 2 есе мөлшерімен 16 сағ бойы, екіншісі-1 сағ бойы жүргізіледі. Экстрактты күнжарадан (жмыха) центрифугалау арқылы бөледі де біріктіреді. Күнжараны инсулин алу үшін пайдаланады, ал экстракттан әр түрлі концентрацияны аммоний сульфатымен (ДНҚ за, РНҚ за) кристалды аммоний сульфатын қанығу дәрежесін анықтауға дейін араластыра және суыта отырып қосады, сосын ферменттерді тұздандырады.

Фильтартты химотрипсин, трипсин және пантрипин алу үшін пайдаланады.

Тұздықты суда ерітеді және сулы ерітіндіде ілеспелі заттарды аммоний сульфатын қоса отырып тұндырады. Тұнбаны тастайды, ал фильтратқа 5 н натрий гидроксидін рН мәні 4,5-ке жеткенше қосады, ДНҚ за-ны аммоний сульфатының қаныққан ерітіндісінің қанығу дәрежесі 0,4 болғанша баяу қоса отырып тұздайды. ДНҚ за тұнбасын бөледі де ары қарай тазалуға кіріседі. Фильтраттан РНҚ - заны аммоний сульфатымен қанығу дәрежесі 0,8 болғанша тұздау арқылы тұндырады. Аморфты РНҚ-азаны тазалайды. Ферменттер комплесінен тұратын фильтраттан қанығу дәрежесі 0,7 кезінде аммоний сульфатымен химотрипсинді, трипсинді және пантрипинді тұздандырады.

Ферменттер қоспасынан белсенді емес химотрипсиноген алады. Ол үшін тұнбаны күкірт қышқылымен рН мәні 3,0 дейін қышқылданған сумен ерітеді, температура 5⁰С–тан аспауы тиіс және араластыру барысында аммоний сульфатының ерітіндісін баяу қосады. Содан соң ерітіндіні 5М натрий гидроксиді ерітіндісімен рН мәні 5,0 болғанша сілтілендіреді және кристалдық химотрипсиногеннің толық тұнбасы түзілгенше температурасында ұстайды.

Химотрипсиногенді бөлгеннен кейін алынған фильтратпен жуылатын судан аммоний сульфатымен 5М күкірт қышқылымен рН мәні 3,0 болғанша қышқылдау барысында тұздауымен трипсиноген түзіледі.

Трипсин түзілген соң қалған фильтратты тұз қышықылымен рН мәні 2,5 болғанша 5⁰С температура кезінде қышқылайды. Қышқылданған фильтарттан кристалдық магний сульфатын қоса отырып пантрипинді балласты ақуызбен бірге тұздайды. Соңғысын, ерітінді 90⁰С температурада қыздыру кезінде және 1минут аралығында және 20-25⁰С температураға дейін тез суытумен каогуляциялау арқылы жояды. Жуылатын сумен біріктірлген фильтратқа бояу араластыра отырып кристалдық аммоний сульфатын қосады және 12 сағат аралығында бөлме температурасында қалдырады. Нәтижесінде екі тұнба түзіледі: амморфты және кристалдық. Қара аморфты пантрипиннің тұнбасын ақ кристалды заттан бөліп алады.

Панкреатин тұнбасын суда ерітеді де диализ біткенше ерітіндіні фильтрлеп диализдейді, құрғақ қалдық пен пантрипиннің ингибирлеуші қызметінің күші бойынша стандарттайды. Стерильдеуші фильтарция жүргізіледі, флакондарға құды да сублимацялық құрғатуға айналдырады.

Жеке ферменттерді тазалау бірнеше күнге созылады және көп реттен тұратын қайталанбалы операциялар қатарынан тұрады.

Ең алдымен ферменттерді аммоний сульфатымен қанығу дәрежесі мен рН мәнінің әртүрлі мәндеріне дейін үш реттік тұздауды жүргізеді. Әр ретте фильтраттан алдын-ала ілеспелі заттарды аммоний сульфатының аз концентрациялы ерітіндісімен жояды, содан соң ферменттерді бес реттік кристалдау жүзеге асады. Химотрипсоноген мен трипсиногенді төменгі температура кезінде және трипсин кристалдарын қоса отырып химотрипсин мен трипсиннің сәйкес буферлі ерітінділерінің түзілуіне дейін белсендіреді. Ферменттерді целлофан пленкасы арқылы дилизбен тұзсыздандырады. Сульфат иондарын барий хлоридімен тұндырады, ал артық барий ионының мөлшерін КУ-2 катионында жояды. Ферменттердің тұзсызданған ерітінділерінде рН-тың қажетті мәнін тұрақтайды, құрғақ заттың концентрациясын анықтайды және флакондағы құрғақ препарттың соңғы үлесіне сәйкес тазартылған сумен сұйылтады. Сұйытылған ертінділерді стерильдеуші фильтр арқылы фильтрлейді, флакондарға құяды да сублимациялық кептіруге айналдырады.

Дезоксирибонуклеаза лиофильденген ақ ұнтақ, суда жеңіл ериді; 0,1% сулы ерітіндінің рН =3,5-5,5 тең болады. Сулы ерітіндіде фермент тұрақсыз (жарамдылық мерзімі 12 сағат), термотұрақты, 55⁰С температурада инактивтеледі. Активтілігін ДНҚ-дан белгілі бір жағдайда препаратпен босатылған қышқылда ерігіш өнімдердің түзілуі бойынша анықталады және ЕА активтілік бірлігінде белгіленеді. 1 мг препаратта 1700 ЕА мәнінен кем болмауы тиіс. Ауа өткізбейтін флаконда 5,10, 25 және 50 мг түрінде шығарылады.

Құрғақ жарықтан қорғалған жерде 20⁰С температурадан жоғары емес температурада сақталады. Деполимерлену және іріңді азайтуды болдыратын, сондай-ақ вирустардың дамуын тежейтін құрал ретінде пайдаланылады. Ингаляциялауға арналған аэрозоль түрінде бекітеді.

Аморфты рибонуклеаза (Ribonucleasum amorphum) – лиофильденген ақ түсті ұнтақ, суда тез ериді. Белсенділігін белгілі бір жағдайда рибонуклеин қышқылының гидролизі нәтижесінде препаратпен босатылған қышқылда ерігіш заттардың мөлшері бойынша биологиялық жолмен анықтайды. 1ЕА 1 мг препаратқа сәйкес келеді. Ауа өткізбейтін флаконда 10, 25 және 50 мг бойынша шығарады. Құрғақ, жарықтан қорғалған жерде, 15⁰С –тен жоғары емес температура кезінде сақтайды. Ингаляцияға арналған аэрозоль түрінде жергілікті, ішкі, бұлшықетке пайдаланады.

Кристалды химотрипсин (Chymotrypsinum crystallisatum) – жылтыр немесе ақ түсті, суда жеңіл еритін зат, 0,2% сулы ерітіндінің рН =4,5-6,5 құрайды. Сулы ерітінділері тез инактивацияланады. Ауа өткізбейтін флаконды 5, 10 мг кристалды химотрипсин шығарылады. Салқын (10⁰С жоғары емес температурада) жарықтан қорғалған жерде сақтайды. Рибонуклеаза ретінде пайдаланды.

Кристалдық трипсин (Trypsinum crystallisatum) – кеуек масса немесе ақ түсті ұнтақ болып табылады, 0,2% сулы ерітіндідегі рН =3,0-3,5 құрайды. Бейтарап және сілітілік ортада препарат тез бұзылады. Ауа өткізбейтін флаконда немесе ампулада 5 және 10 мг бойынша шығарылады. Құрғақ, жарықтан қорғалған жерде, 10⁰С-тан жоғары емес температура кезінде сақтайды. Химотрипсин ретінде пайдаланылады.

Пантрипин (Pantrypinum) – протеаз ингибиторы (трипсин, химотрипсин және т.б.), сары түсті лиофильденген ұнтақ, суда жақсы ериді. Биологиялық жолмен трипсин белсенділігін төмендету қабілеттілігі бойынша стандарттайды. Ауа өткізбейтін флаконда 6,12,15,20 және 30 Е бойынша шығарылады. Құрғақ, жарықтан қорғалған жерде, 20⁰С –тан жоғары емес температура кезінде сақталады. Панкреатин кезінде қолданылады, күретамырға енгізіледі.

Ронидаза (Ronidasum) – гиалуронидаза ферментінен тұратын препарат, жыныс жағынан жетілген ірі мүйізді мал тұқымынан алынады.

Тұқымдары 2% фенол ерітіндісімен 5-15 минут бойы өңдейді, мұқият сумен жуады, қабығын аршиды да диірменде ұнтақтайды. Ұсақталған тұқымдарға 1,0:0,5 қатынасындағы 0,25 % хлороформнан тұратын физиологиялық ерітінді құяды және ренидазаны 35-40 минут бойы араластыра отырып экстракциялайды. Экстрактты фильтрлеу арқылы бөліп алады, тұнбаны гидравликалық пресспен қысады, қысылған сұйықтықты экстрактке байланыстырады, кассета бойынша тот баспайтын болаттан құяды, сублимация әдісімен кептіреді. Кепкен препаратты шар диірменінде ұсақтайды, ауа өтбейтіндеі етіп жапсырады. Бөлме температурасында, жарықтан қорғалған жерде сақтайды. Сыртқа тыртықтарды (күйіктен қалған, операциядан кейінгі) емдеу үшін қолданылады.

Лидаза (Lydasum) – гиалуронидаздық қызмет атқаратын препарат. Лидазаны алу үшін ірі қара мүйізді малдың ұсақталған тұқымын 1:2 қатынасындағы сірке қышқылының 0,1 М ерітіндісімен 10⁰С температура кезінде және 4 сағат бойы араластыра отырып өңдейді. Тұнған сұйықтықты бөледі де гиалуронидаза ферментін ацетонмен тұндырады. Тұнбаны суда ерітеді және тұндыру үдерісін ацетонмен 3 рет қайталайды. Ацетоннан босатылған гиалуронидазадан тазартылған тұнбаны суда ерітеді, стерильдейтін фильтр арқылы фильтрлейді, флакондарға құяды және сублимация әдісімен кептіреді.

Стерильді құрғақ заттың 64 ШБ (шартты бірлігі) бойынша флакондармен шығарылады. Құрғақ қараңғы жерде, 15⁰С –тан жоғары емес температурада сақтайды. Лидазаның пайдалануының негізгі көрсеткіштері буын ауыру, күйік пен операциялардан қалған тыртықтар, спондиолар-трит, гематомалар және т.б. Ерітіндіні теріге енгізеді [10, 39].