Регистрация времен затухания люминесценции

Знание времен жизни люминесценции дает информацию о физических процессах в возбужденном состоянии, позволяет оценить скорости переноса энергии фотовозбуждения, частоту столкновений с молекулами тушителей, детально исследовать взаимодействие люминофора с его окружением.

Главным параметром кинетики люминесценции является время затухания люминесценции, которое представляет собой средний промежуток времени, в течение которого атом или молекула находятся в возбужденном состоянии. Затухание свечения единственного люминофора можно описать экспоненциальным законом вида:

,

где I₀ – интенсивность люминесценции в начальный момент времени t=0, τ – время затухания. Зачастую кривую затухания люминесценции нельзя представить в виде одноэкспоненциальной зависимости, однако можно представить в виде суммы экспонент, каждой со своим временем затухания τ_i и предэкспоненциальным множителем α_i. Многоэкспоненциальный закон затухания люминесценции может свидетельствовать о множестве физический явлений: различном окружении для отдельных люминофоров одного типа; присутствии смеси различных люминофоров; наличии процессов, происходящих в возбужденном состоянии. При этом каждый процесс характеризуется своей экспонентой. При этом надо учитывать, что не всегда подобранные значения τ_i и α_i точно характеризуют определенные спектральные свойства исследуемой системы и вообще имеют физический смысл.

Измерение времен затухания люминесценции возможно с применением модулированного непрерывного источника излучения (метод фазового сдвига, а также вариации метода синхронного детектирования). Но гораздо проще ситуация, когда образец возбуждается световым импульсом, длительность заднего фронта которого много короче среднего времени жизни возбужденного состояния. Последующие кривые распада регистрируются по уменьшению люминесценции, которую можно либо непосредственно наблюдать на экране осциллографа либо регистрировать с помощью иного метода, выбор которого зависит от характерного времени затухания [6].

Осциллографический метод применим для анализа относительно больших времен (с временным разрешением не менее нескольких нс). При недостаточном уровне сигнала возможно применение накопление с последующим усреднением [16], а также переход к счету одиночных фотонов.

Самые короткие оптические времена регистрируются с помощью электронно-оптических стрик-камер, принцип действия которых немного схож с кинескопом – анализируемый световой импульс с помощью фотокатода преобразуется в поток электронов, которые ускоряются и отклоняются в поле электромагнитной развертки, образуя на приемном экране пространственную картину распределения во времени (рис. 19). Такие стрик-камеры позволяют разворачивать импульсы длительностью от 100 фс. Времена менее фемтосекунды позволяют развернуть стрик-камеры, в которых отклонение электронов осуществляется с помощью оптического излучения (требуемая частота развертки находится уже в оптическом диапазоне).

Рис. 19 Схема классической стрик-камеры [17]

Регистрация времен затухания люминесценции в режиме счета фотонов

Тремя основными режимами счета фотонов являются гейтированный (gated photon counting, GPC), многоканальный (multichannel scaling, MCS) и время-коррелированный (time correlated single photon counting, TCSPC) режимы (рис. 20).

При гейтированном счете счетчик включается на определенный временной интервал (гейт), в течение которого производится подсчет всех импульсов, амплитуда которых больше определенного уровня (Threshold). Повторение измерения с разной величиной задержки позволяет получить временную форму сигнала. Время прихода отдельных фотонов не регистрируется, а подсчитывает их количество внутри интервала. Поэтому основное применение метода – это выделение части фотонов из общего количества излученных. Например, отделение фотонов люминесценции от рассеяния, либо фосфоресценции от флуоресценции.

Многоканальный счет можно представить как счет с помощью множества гейтированных счетчиков, при котором детектируемые фотоны подсчитываются по времени прибытия в разных ячейках памяти. Временное распределение в таком случае может быть получено сразу.

При время-коррелированном счете подсчитывается только один фотон, зарегистрированный детектором после импульса возбуждения. Такой способ обеспечивает наиболее точное измерение времени среди этих методов, до нескольких пс. Но для получения полной формы сигнала нужно многократное повторение эксперимента.

Рис. 20 Сравнение режимов счета фотонов. Слева направо – время-коррелированный счет (TCSPC), гейтированный (GPC) и многоканальный счет (MCS). N – количество измерений. Каждая строчка соответствует отдельному импульсу возбуждения. Полная форма сигналам может быть восстановлена, теоретически, в единичном MCS эксперименте. В TCSPC один отсчет получается в результате, в среднем, 100 экспериментов. Высота гистограммы (и интенсивность сигнала) может быть на порядки ниже полученной при сопоставимом числе измерений методом MCS. Это самый медленный способ получения гистограммы, но с самым высоким разрешением. В GPC методе положение окна должно меняться для построения временного профиля. Результирующая амплитуда, поэтому, будет в 10-1000 раз меньше [18].

Первоначально, из-за низкой скорости переключения цифровых управляющих элементов и усилителей, временные интервалы менее 1 нс (а чаще 5 нс) при гейтированном и многоканальном счете не использовались, эта величина ограничивала временное разрешение метода. В настоящее время обычно используют один сбрасываемый счетчик, быстродействие позволяет работать с разрешением в сотни пс, а время-коррелированный и многоканальный счет реализуется одной и той же схемой на цифровых элементах.

Время-коррелированный счет

Рассмотрим метод время-коррелированного счета подробнее. Измерение пикосекундных времен – нетривиальная задача. При TCSPC отсчет времени ведется при помощи блока преобразования «время-амплитуда» TAC (time-amplitude convertor) либо прямого «time to digital» TDC (time-digital convertor). Принцип преобразования напряжения во время TAC прост – при зарядке постоянным током напряжение U на обкладках конденсатора, подключенного к выходу ОУ, до наступления насыщения будет пропорционально времени зарядки t: U=a×t. Зафиксированное в момент прихода импульса напряжение записывается и преобразуется во время с помощью АЦП (ADC, аналого-цифровое преобразование). Многократное повторение измерения позволяет построить распределение импульсов во времени (рис. 21). Этот метод позволяет измерять времена с точностью до десятков пикосекунд.

При регистрации применяют два варианта счета – прямой и обратный. При первом блок ТАС включается одновременно с импульсом возбуждения, при регистрации фотона рост напряжения прекращается, а его значение измеряется и преобразуется в значение времени. При обратном счете ТАС включается только при регистрации фотона, а рост напряжения прекращается при следующем импульсе возбуждения. Прямой счет не требует стабильности частоты возбуждающих импульсов и проще для понимания. Однако до недавнего времени основным способом являлся обратный счет, т.к. такое включение ТАС не вносит помех в период ожидания импульса, а также не требует запуска схемы регистрации с полной частотой возбуждения (на что старые схемы были не способны).

Способ TDC предусматривает измерение с помощью быстродействующей цифровой линии задержки, где известно время задержки сигнала на каждом элементе цепи. Такой способ также позволяет считать более одного фотона за период, и вести прямой, а не обратный отсчет.

Для корректной работы время-коррелированного метода в один период возбуждения не должно приходить более одного импульса люминесценции, поскольку следующий импульс зарегистрирован не будет. Распределение импульсов люминесценции во времени описывается законом Пуассона, поэтому вероятностью появления второго импульса можно пренебречь, только если в среднем на 20 импульсов возбуждения будет регистрироваться менее одного импульса (а еще лучше – на 100 импульсов). Наложение импульсов на один период искажает гистограмму распределения. По этой причине метод плохо подходит для измерения времен более 100 нс, т.к. приводит к очень большим временам накопления. Поэтому для больших времен применяют мультискалярный счет, либо реализуют время-коррелированный счет внутри последовательных коротких интервалов, как при гейтированном.

Рис. 21 Схема построения гистограммы распределения импульсов при время-коррелированном счете. Время регистрации каждого импульса сохраняется в память, и гистограмма распределения представляет зависимость интенсивности люминесценции от времени [19]

Добавим, что теория детектирования отдельных фотонов в полуклассическом приближении описана в [20], с.73.

Дискриминаторы CFD

В устройствах, обеспечивающих счет фотонов, широко используются дискриминаторы не по абсолютному уровню сигнала, а по его доле относительно максимума, или CFD (Constant-Fraction Discriminator). Дискриминация по абсолютному уровню вносит большую погрешность в значение времени прихода сигнала, если импульсы имеют одинаковую форму, но разную амплитуду, что обычно бывает при регистрации импульсов ФЭУ или ЛФД (рис. 22).

Рис. 22 Однофотонные импульсы ФЭУ. Полоса пропускания осциллографа 500 МГц, временной масштаб 2 нс, чувствительность 20 мВ [21]

В дискриминаторах CFD входной сигнал разделяется на два, один из которых задерживается и инвертируется. После суммирования сигналов образуется двухполярный импульс, для которого точка пересечения нулевой линии остается постоянной, независимо от амплитуды импульса (рис. 23).

Рис. 23 Принцип работы CFD. D1 и D2 – дискриминаторы. D1 выбирает импульсы, амплитуда которых превышает заданный пороговый уровень CFD Threshold. D2 измеряет разность между входным импульсом и им же, но инвертированным и задержанным. Положение нулевой точки пересечения не зависит от амплитуды импульса. Таким образом CFD генерирует выходной сигнал при пересечении нуля дифференциальным напряжением, если входной сигнал удовлетворяет значению CFD Threshold. [22]

Это позволяет регистрировать импульсы разной амплитуды в положении одного и того же процентного отношения от максимума. Второй задачей CFD является дискриминация импульсов малой амплитуды – шумовых либо слабых, время прихода которых точно определить затруднительно. Поэтому задаются два уровня дискриминации: уровень пересечения нуля CFD Zero Cross Level и уровень срабатывания триггера CFD Threshold.

Настройка системы счета фотонов [21]

Помимо общих рекомендаций по борьбе с электромагнитными помехами, при время-коррелированном счете также необходимо придерживаться следующих рекомендаций.

При регистрации IRF [21]:

1. При регистрации IRF (Instrumental Response Function) ошибки чаще всего возникают при использовании в качестве образцов рассеивающих растворов или кювет большого диаметра. Так, использование обычной 10 мм кюветы может добавить 100 пс к измеряемому значению. Прохождение луча через оптическую систему, особенно содержащую сильно отражающие поверхности (такие как интерференционные фильтры) может привести к появлению вторичных пиков. Присутствие в оптической схеме монохроматора может внести существенную зависимость от длины волны. Поэтому наиболее надежный способ измерения – это поместить достаточный набор нейтральных светофильтров перед приемником и напрямую осветить лазером.

2. Следует избегать импульсов малой амплитуды, т.к. их временная стабильность (timing jitter) хуже, а подверженность влиянию электрическим помехам – выше. По этой причине при регистрации времени появления импульсов, имеющих разброс по амплитуде (что бывает при работе с ФЭУ), иногда имеет смысл повысить уровень дискриминатора, потеряв основную часть импульсов, но улучшив временное разрешение.

При работе с CFD [21]:

1. Конфигурация CFD (Constant Fraction Discriminator) уровней.

Полоса пропускания дискриминатора CFD входа зависит от амплитуды входного сигнала. Длина кабелей сказывается на форме распространяющихся сигналов. Это приводит к необходимости настройки уровней после изменения конфигурации подключения. Что важно, сигнал не должен быть завышен, а форма искажена.

2. Необходимо избегать неоправданно низкого уровня порога CFD из-за взаимного влияния между входами детектора и опорного сигнала. Низкое усиление детектора вместе с низким уровнем дискриминации может привести к появлению множества импульсов малой амплитуды, подверженных такому влиянию.

3. Счетчики фотонов имеют повышенную вероятность зарегистрировать темновой импульс в течение первых сотен наносекунд после детектирования фотона (Afterpulsing). Источник такого шума в ФЭУ – ионизация остаточного газа, в ЛФД – носители, захваченные по время предыдущей лавины. При экспериментах на высокой скорости счета такие «послеимпульсы» накапливаются в течение нескольких периодов возбуждения и образуют зависящий от скорости счета фон. Признак этого явления – темновой фон, превышающий обычный уровень в несколько раз. Обычно пропадает при уменьшении усиления.

4. В общем случае попытка уменьшить темновой счет путем уменьшения усиления или увеличением порога CFD не ведет к улучшению ситуации, поскольку темновые импульсы имеют такое же амплитудное распределение, и исключаются только электрические шумы. Это даже может дать видимое увеличение темнового счета, а также медленное повышение уровня примерно через 10 нс после импульса. Причиной этого являются «послеимпульсы». Более того, средняя амплитуда «послеимпульсов» выше амплитуды световых импульсов, и они не вызывают релаксации ФЭУ – «dead time» – и могут появляться внутри них. Поэтому чрезмерно большой уровень порога CFD приведет к подавлению световых импульсов и росту доли «послеимпульсов».

5. Также слишком высокий уровень порога CFD может привести к тому, что регистрироваться будут только многофотонные импульсы, и форма регистрируемого импульса полностью исказиться, а IRF может достичь очень малой длительности, не имеющей отношения к рабочим параметрам системы (хотя это явление часто используют в лазерных дальномерах).

6. CFD уровень нуля минимизирует временную нестабильность регистрации импульса. Теоретически лучшее значение этого уровня – нулевое. Но на практике это значение имеет смещение несколько мВ. Более того, собственная задержка дискриминатора зависит от амплитуды сигнала, поэтому лучше всего сместить уровень нуля CFD на несколько десятков мВ в ту или иную сторону. При малом уровне дискриминатор может срабатывать от ложного сигнала от канала синхронизации или от осцилляций в цепи. Противоположная ситуация – слишком высокий уровень нуля CFD в комбинации с низким уровнем триггера CFD приведет к отсутствию импульсов на выходе.

7. Изменение нулевого уровня CFD влияет на временное положение импульса в пределах долей нс, поскольку фронт разностного сигнала имеет наклон.

Оптимизация параметров синхронизации

Вход SYNC

Как правило, значение параметра SYNC оказывает мало влияния на временное разрешение, поскольку амплитуда сигнала синхронизации стабильна. Тем не менее, если сигнал синхронизации имеет отражения, звон или «послеимпульсы», то возможно возникновение ложного срабатывания.

Настройка длины пути импульсов SYNC и SIGNAL

Положение интервала регистрации импульсов внутри измеряемого периода зависит от длины кабелей, оптического пути и приборных задержек, и не всегда оптимально. Рассмотрим основные пути коррекции.

Увеличение длины SYNC кабеля сдвигает кривую сигнала влево на шкале времени, увеличение длины SIGNAL кабеля и оптического пути измеряемого сигнала – вправо. Сдвиг величиной 1 нс примерно равен 30 см оптического пути или 20 см длины кабеля.

Поскольку длительность периода измерения меньше периода сигнала, временная кривая может быть сдвинута также параметром “TAC Offset”. Однако надо избегать попадания измеряемого сигнала за пределы границ периода работы блока TAC, поскольку это приведет к искажению сигнала, т.к. вне этих границ счет не ведется, а в начале работы блок ведет себя нелинейно.

В режиме обратного TCSPC счета значение имеет положение опорного импульса, останавливающего счет. Его задержка от начала регистрируемого импульса должна составлять сумму временной задержки приемника, ширины регистрируемого интервала, и несколько нс, необходимых для запуска блока ТАС. В ином случае часть импульса окажется вне зоны счета, или в счет попадут импульсы из соседнего периода. Наиболее подходящим способом в такой ситуации является введение задержки импульса SYNC с помощью кабеля.

Паразитная связь сигналов

Часто возникает паразитная связь опорного и сигнального кабелей, а также SIGNAL и SYNC цепями. Не следует пренебрегать экранированием детектора и лазера, т.к. проникновение помехи от лазера – наиболее частый источник помех. Следует пространственно разделять сигнальный и опорный кабели, избегать большой амплитуды импульсов SIGNAL и малой SYNC, и наоборот.

Dead Time

Dead time – это время, в течении которого система «слепа» после регистрации очередного фотона. Эта величина не только ограничивает скорость счета, но также вносит искажения в форму сигнала и ошибки в измерения интенсивности. Следует избегать ситуации, когда в интервал Dead time попадает следующий фотон, поскольку он не будет зарегистрирован, что исказит распределение фотонов по времени.

Потери в счете

Поскольку время прихода фотона имеет вероятностную природу, часть из них теряется в любом случае. Но при настройке системы часто имеет смысл выяснить, теряются они из-за случаев, вызванных Dead Time, или по другим причинам? Для этого существует формула вычисления эффективности счета E:

,

где r₀ – частота входных импульсов, t_d – dead time, r – регистрируемая частота импульсов. Из-за этого при уровне выше 10% от скорости счета приемника эффективность заметно нелинейна. При временных измерениях TCSPC эти потери не искажают результат, но приводят к «насыщению» при измерении интенсивности или спектров. Максимальная полезная скорость счета считается 50% от максимальной.

Pile-Up эффект

Классический Pile-Up эффект заключается в том, что в течение одного периода регистрируется только один фотон, следовательно второй игнорируется. Это приводит к искажению распределения (т.е. формы регистрируемого сигнала). Явление наблюдается на скорости счета выше нескольких процентов от максимальной, и, если на один импульс возбуждения приходят сотни и тысячи фотонов, то длительность искаженного зарегистрированного импульса может оказаться даже меньше временного разрешения детектора. Pile-Up эффект сильнее всего проявляется в измерениях с килогерцовой частотой следования импульсов возбуждения высокой мощности.

Межимпульсный Pile-Up эффект проявляется в экспериментах на высокой частоте. После периода dead time система включается на прием посреди очередного импульса, следовательно, фотоны в первую часть периода импульса не регистрируются. Будучи усредненным по большому числу измерений, результат проявляется как ступенька в распределении, искажая форму сигнала

Способы предотвращения Pile-Up эффекта

1. Измерения на низкой частоте.

Основная проблема – классический Pile-Up эффект. Общий рецепт – снижение интенсивности сигнала. Предпринимались попытки учитывать либо исключать из счета фотон, если в тот же период приходил второй, либо учитывать и второй фотон. В первом случае так исключается много полезных фотонов, т.к. второй импульс часто вызывается отражениями, звоном в цепи и пр. Если сигнал люминесценции короткий, менее нескольких нс, то два фотона все равно не различить, и они пройдут как один. Если длительность люминесценции больше, то можно, в принципе, подсчитывать переходы через порог дискриминатора CFD.

Второй метод стал возможен с переходом на цифровые схемы регистрации TDC (time-to-digital conversion), однако также столкнулся с pile-up. Одним из выходов является многодетекторная регистрация, т.к. в таком случае вероятность многофотонного события в одном детекторе уменьшается. Также можно использовать несколько каналов счета.

2. Измерения на высокой частоте

Присутствуют оба типа эффекта pile-up. Они зависят от соотношения скорости счета к частоте следования импульсов, или, что точнее, частоте стоп-сигнала блока TAC. Потери в счете зависят от отношения dead time и частоты стоп-сигнала. Следовательно, все вышеперечисленное минимизируется поддержанием высокой эффективной частоты стоп-сигнала блока TAC. Следует избегать длинных интервалов старт-стоп, выбирая правильную задержку. Иногда можно пренебречь полным затуханием люминесценции и выбрать меньший период следования импульсов, поскольку скорректировать неполное затухание проще, чем pile-up эффект.

Настройка оптической системы

Обычно оптическая система собирает менее 10% излучения образца, и наибольший потенциал в увеличении сигнала находится именно тут, а не в самом приемнике. Хорошая оптическая система не только увеличивает эффективность детектирования, но и уменьшает типичные ошибки, вызванные искажением сигнала при отражении, временной дисперсией, нестабильностью или зависимостью IRF от длины волны, или проникновением возбуждающего или дневного излучения.

Вопросы для самопроверки:

• Что такое dead-time применительно к однофотонному ФЭУ, однофотонному лавинному фотодиоду?

• К чему ведет превышение максимальной скорости счета импульсов в режиме счета фотонов?

• В чем задачи дискриминатора?

• Каким законом описывается затухание свечения единичного флуорофора?

• Во сколько раз скорость следования регистрируемых фотонов при время-коррелированном счете возбуждения должна быть меньше скорости следования импульсов возбуждения?

• Каким законом описывается распределение фотонов люминесценции во времени?

• Какое отличие дискриминаторов CDF от обычных пороговых дискриминаторов?

• Какой длине электрического кабеля равен сдвиг величиной 1 нс?

• К чему приводит классический Pile-Up эффект?

• Как растет вклад случайных шумов при многократном измерении N раз?