7. Получение in vitro каллусных культур растений

Поверхностное культивирование

Культура каллусных тканей выращивается поверхностным способом на полужидкой агаризованной среде (концентрация агара - 0,6-1 %), среде с применением других желирующих полимеров либо на мостиках из фильтровальной бумаги или дисках из пенополиуретана, погруженных в жидкую питательную среду. Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белым, желтоватым, зеленым или красным; пигментированным полностью или зонально. Как правило, в длительной пересадочной культуре каллусные ткани теряют пигментацию и становятся более рыхлыми. Каллусные клетки, выращиваемые поверхностным способом, часто применяют для сохранения в растущем состоянии коллекций разных штаммов, линий, мутантов, для регенерации растений, из них также получают суспензии клеток, культивируемых в жидкой питательной среде.

Суспензионное культивирование

Культуры клеток растений, выращиваемые в жидкой питательной среде, обычно называют суспензионными (глубинными) культурами. Существуют определенные проблемы получения культуры, состоящей преимущественно из отдельных клеток или небольших их агрегатов. Для решения этих проблем используют методы получения клеточной суспензии применительно к растительным клеткам.

Выращивание клеточных суспензий в жидкой питательной среде имеет ряд преимуществ перед выращиванием каллусных клеток поверхностным способом. Суспензионные культуры удобнее для проведения биохимических и молекулярно-биологических экспериментов - изучения индукции ферментов и связи их с событиями клеточного цикла, экспрессии и репрессии определенных генов, изолирования и характеристик мутантов.

Суспензионную культуру можно получить из фрагментов органа растения (диски паренхимы и др.), хотя этот путь более трудоемкий и требует большего времени. Клетки экспланта должны при этом образовывать первичный каллус, и только после этого поверхностные каллусные клетки, попавшие в жидкую среду и размножившиеся в ней, дадут начало линии, способной расти в суспензии. Обычно для получения культуры клеток используется культура каллусной ткани. Для получения культуры клеток берется наиболее жизнеспособная (пролиферирующая) часть каллусной ткани, а ее количество в расчете на единицу объема питательной среды должно быть в 15-20 раз больше, чем при серийном культивировании на агаре. При этом может использоваться питательная среда того же состава, что и для поверхностного культивирования.

Образование первичной суспензии растительных клеток может быть результатом трех процессов:

- распада каллусной ткани на клетки и небольшие клеточные агрегаты в момент внесения в жидкую питательную среду;

- отделения клеток и клеточных агрегатов с поверхности кусочков ткани в течение первых субкультивирований;

- деления и роста клеток и распада разрастающихся клеточных агрегатов на более мелкие агрегаты и клетки.

Первичную суспензию перед субкультивированием разделяют на фракции по скорости седиментации, используя специальный цилиндр (берут верхнюю фракцию), либо фильтруют через 1-2 слоя марли, нейлоновые или металлические сита, чтобы избавиться от крупных плотных кусков каллусной ткани, остатков экспланта и очень крупных агрегатов.